辽宁省义县西葫芦“死秧”致病病原菌的鉴定

王丽丽苗则彦王 鑫吴海东刘爱群

(1辽宁省农业科学院蔬菜研究所，辽宁 沈阳 110161； 2.辽宁省农业科学院植物保护研究所，辽宁 沈阳110161)

20世纪80年代，辽宁省义县开始发展设施西葫芦(CucurbitapepoL.ssp.pepo)生产。至今，日光温室西葫芦生产面积达3 300 hm2，占当地设施蔬菜总面积的41.25%，成为辽宁省反季节西葫芦栽培主产区[1]。当地西葫芦主栽品种为凯撒，主要以自根苗栽培为主，嫁接栽培技术应用较少。近年来，由于连续多年的单一茬口重茬种植，当地生产中“死秧”现象普遍发生，严重地块发病率达75%以上，成为制约义县西葫芦产业发展的重要因素。辽宁省有关专家到发病区鉴定，初步认为是尖孢镰刀菌引起的枯萎病或者是茄病镰刀菌引起的根腐病，但不能确定是哪类菌源。有研究报道辽宁地区引起嫁接黄瓜“死秧”问题的病原菌为茄病镰刀菌瓜类专化型(Fusariumsolanif.sp.Cucurbitae)，并对该菌致病特征、侵染途径等做了详细报道[2]。该病菌引起的发病症状为在茎基部与土壤相接处呈现水浸状褐色病斑，局部萎蔫，严重发病植株并未枯萎而直接倒伏，扒开基质可见根茎部发病较严重，根部受害并不重，发病症状与义县西葫芦类似。该病害初步定名为根茎腐病[3]。

有关茄病镰刀菌瓜类专化型病原菌在国内报道较少。1932年最早在南非报道引起南瓜根茎腐病，随后在荷兰嫁接黄瓜爆发[4]。最初发现该病原菌也只在田间侵染南瓜，未在甜瓜、西瓜等瓜类作物发生。随着病原菌的发展，随后在欧美国家陆续报道，甚至在西班牙的西瓜、西葫芦、甜瓜作物均被侵染致病[5～7]。随着病原菌鉴定技术不断更新，鉴定手段从形态学鉴定到分子生物学鉴定，研究者进一步将该专化型真菌划分为2个生理小种[8]，并做了大量分子生物学研究[9～10]。目前，真菌测序分析常见方法为ITS序列分析方法，该方法不能准确判断出病原菌的种级分类水平。为了更准确鉴定辽宁义县地区的致病菌是否为茄病镰刀菌瓜类专化型，本研究采用rDNAITS、EF序列分析方法，进行分子生物学鉴定，并设计专化型验证试验，旨在为生产提供有力理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

2018 年，以辽宁省义县前窖、龙王庙、头沟3个地方5个试点感病西葫芦的植株为试材，进行室内培养。

1.2 病原菌的分离鉴定

采用传统的组织分离法对病样进行病原物的分离纯化。PDA培养基配置： 200 g马铃薯切片加适量水煮30 min后过滤，取滤液加15 g葡萄糖，15 g琼脂，定容至1 L，121 ℃湿热灭菌20 min待用。培养前在PDA培养基内加少量青霉素、链霉素，在直径90 cm培养皿无菌条件培养。将分离得到的菌株在恒温培养箱中25 ℃条件下培养5 d，挑取尖端菌丝，培养至产生分生孢子，进行单孢纯化，并将纯化后的菌株保存在PDA培养基上，4 ℃保存。

1.3 Koch's 法则鉴定致病性

根据Koch's 法则，将分离获得的单孢菌株回接鉴定致病性。以西葫芦“莱特”品种为试材，采用32孔穴盘，每个单孢菌株接菌一盘，3次重复。播种前催芽，待种子刚露白时播种到菌土中。接菌方法参照刘洋(2010)方法。调查植株发病情况，选取出现类似症状的植株根茎部进行病原菌的再次分离鉴定确定所得单孢菌株是否为田间致病菌。

1.4 专化型鉴定试验

选择11种蔬菜作物进行接种鉴定，品种见表1。

表1 蔬菜作物品种及来源

1.5 病原菌测序方法

真菌DNA采用试剂盒[OMEGE Fungal DNA Kit(50)试剂盒 (美国)]方法提取。真菌ITS序列及EF-1α序列分析比较，序列见表2。PCR反应体系(20 μl)：DNA 模板2 μl、10×Buffer(含Mg2+)2 μl、Taq polymerase(5 U/μl)0.4 μl，引物(10 μmol /μl)各1 μl，dNTP(10 mmol/ L)4μl，ddH2O 10 μl。反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳纯化后委托北京诺赛基因组研究中心有限公司进行测序。将测序结果在NCBI核算序列数据库中进行BLAST同源性搜索比对，获得基因登录号。

表2 ITS和EF引物序列

2 结果与分析

2.1 病原菌鉴定

2.1.1 病原菌的形态学鉴定

病原菌形态学观察表明，菌落薄绒状，气生菌丝较少，白色至浅灰色；菌落背面中心呈褐色。小型分生孢子数量多，有大型分生孢子(图1)。

2.1.2 Koch's 法致病性鉴定

对获得的109个单孢菌群进行回接鉴定致病性结果表明，不同来源菌株均可使西葫芦发病，发病率最高达100%，且发病植株症状与辽宁义县地区田间植株发病症状一致，确定分离获得的109个菌株均为田间致病病原菌。

2.1.3 病原菌的分子生物学鉴定

利用ITS、EF序列对109个单孢菌株进行测序分析，结果表明，ITS序列分析结果为茄病镰刀菌(Fusariumsolani)，登录号为MN523142.1，相似度达99.61%。同时，Nectriahaematococca为镰刀菌瓜类专化型的有性态，登录号为AF178410.1，相似度达99.40%，在NCBI同源性比对结果中将其无性态描述为茄病镰刀菌瓜类专化型(Fusariumsolanif.sp.cucurbitae)。EF序列测序结果与ITS结果一致，且能准确鉴定为茄病镰刀菌瓜类转化型，登录号为KF372878.1，相似度为100%(表4)。

2.2 专化型鉴定试验

选择登陆号为KF372878.1(茄镰刀菌瓜类专化型)的菌种，对11种蔬菜作物进行接种鉴定。结果表明，西葫芦、黄瓜、甜瓜、西瓜、瓠瓜、南瓜、西瓜均不同程度发病，其中西葫芦、甜瓜、南瓜发病最重，达100%。甜瓜发病最早，而番茄、辣椒、菜豆、茄子均未发病(表5)，说明该菌为瓜类作物专化型真菌。

表3 不同来源菌株的致病性鉴定结果

表4 病原菌测定基因序列匹配信息

表5 致病性调查结果

3 结论与讨论

试验鉴定结果表明，引起辽宁义县西葫芦“死秧”的病原菌主要为茄病镰刀菌瓜类专化型病原菌。比较ITS、EF序列分析结果，EF序列测序可获得与NCBI中已有序列同源性更高的菌种信息，相似度达100%。专化型验证试验结果表明，只有瓜类蔬菜作物西葫芦、黄瓜、甜瓜、西瓜、瓠瓜、南瓜不同程度发病，非瓜类作物番茄、辣椒、菜豆、茄子均未发病，进一步证明了鉴定结果的一致性。

国外早期报道，茄病镰刀菌瓜类专化型包括2个生理小种。生理小种1可以侵染植株的茎基、根及果实，引起茎基、根及果实腐烂；而生理小种2只侵染果实引起果实腐烂。由生理小种1引起的根茎腐病最早在荷兰小胡瓜有报道[11]，随后在西班牙葫芦[12]、西瓜、温室西葫芦、甜瓜作物相继报道。本试验中日光温室西葫芦发病特征主要是在茎基部，所以，应该属于生理小种1引起的。目前，国内还未见报道。

真菌分子生物学鉴定方法一般采用rDNA-ITS基因序列分析。本试验采用rDNA-ITS、EF两种基因的序列分析，鉴定结果均为茄病镰刀菌瓜类专化型病原菌，结果一致。其中，利用ITS序列分析，在NCBI基因库比对结果为茄病镰刀菌的有性态，其无性态描述为茄病镰刀菌瓜类专化型。而EF基因序列分析鉴定结果准确度更高，获得的真菌信息更全面，且相似度达到100%。不同的序列分析方法对不同菌种有着不同的适应性。对于建立病原菌种属关系，构建系统发育树，单纯采用ITS序列分析方法不能准确判断出病原菌的种级分类水平，而EF序列分析鉴定结果可以获得同源性较高的菌种信息[13]。所以，本试验采用ITS、EF两种序列分析，提高鉴定结果的准确性。

对11个蔬菜作物接种鉴定表明，该菌具有专化性。这与前人实验室接种鉴定致病性的结果一致[2]。人们对茄病镰刀菌瓜类专化型病原菌的特性、致病特征、侵染途径及侵染作物等做了详细报道，但至今也未筛选出抗病砧木，药剂筛选也未见报道，生产中亟需建立一套高效病害防控技术体系，解决由该病原菌引起的土传病害。