藤茶总黄酮固体脂质纳米粒抗肝癌活性及其药动学研究

杨毛毛，罗花彩，徐 伟，林珠灿*，郭素华，沙 玫*

（1.福建中医药大学药学院，福建 福州 350122；2.福建中医药大学附属人民医院，福建 福州 350004）

肝癌为常见的恶性肿瘤之一，近年来其发病率呈上升趋势，严重威胁人类健康［1-2］，但目前市场上的广谱抗肝癌药物往往会对人体免疫力、器官等造成不同程度的损害。前期报道，藤茶所含的黄酮在抗肿瘤方面效果明显，并有潜力开发为抗肝癌辅助药物［3-6］，但其主要成分二氢杨梅素（占总黄酮含有量的82%以上［7］）的结构中含3，5，7，3′，4′，5′-六酚羟基，易被氧化，而且体内消除快，口服吸收差，生物利用度低［8-9］，严重影响体内药效和临床应用，故需通过新型给药系统来改善其稳定性和生物利用度。

固体脂质纳米粒是一种具有比表面积大、无生物毒性、可控释、靶向性良好、能降低不良反应等诸多优势的载药体系［10-11］，课题组前期已对藤茶总黄酮固体脂质纳米粒制备工艺进行优化［12］。本实验在此基础上进一步考察该制剂的抗肝癌活性，并对主要成分二氢杨梅素的药动学进行研究，以期为藤茶总黄酮及其新制剂的后续开发及临床应用提供依据。

1 材料

电子天平［梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］；Infinite200 PRO 多功能酶标仪（瑞士Tecan公司）；TS100 倒置显微镜（日本尼康公司）；Galaxy 170R 型CO2培养箱（瑞轩电子科技上海有限公司）；LCMS-8045 岛津液质联用仪（日本岛津公司）。

藤茶总黄酮提取物及固体脂质纳米粒均为课题组自制（二氢杨梅素质量浓度为40.15 mg/mL）。环磷酰胺（批号113842，商品名安道生）；顺铂（批号B1210L79601，铂质量分数65%）；二氢杨梅素对照品（批号160422，纯度≥98.0%，上海源叶生物科技有限公司）；二氢槲皮素对照品（批号BA09B006，纯度＞98.0%，成都普思生物科技股份有限公司）；

鼠源性肝癌细胞（H22）、人肝癌细胞（HepG2）细胞株均由福建中医药大学药学院陈莉课题组惠赠。清洁级ICR 雄性小鼠，体质量18～22 g；SD 雄性大鼠，体质量（220±20）g，均购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物生产许可证号分别为SCXK（沪）2017-0005、SCXK（沪）2017-0002。

2 方法

2.1 HepG2 细胞增殖抑制率测定 采用MTT法［6，13］。将对数生长期的HepG2 细胞用0.25% 胰蛋白酶消化，完全培养液（DMEM 高糖+10%胎牛血清+1%双抗）配成单细胞悬液（5×104/mL）后接种于96 孔培养板（100 μL/孔）上，置于CO2培养箱中，在37 ℃、5% CO2条件下进行培养。待各孔中细胞完全贴壁后给药，设置对照组、阳性药（顺铂）组（0.5、1.0、2.5、5.0、25.0、50.0 μg/mL）、藤茶总黄酮组、藤茶总黄酮固体脂质纳米粒组、空白纳米粒组（5、10、25、50、100、200 μg/mL），每个质量浓度设5 个复孔（150 μL/孔），继续在37 ℃、5% CO2条件下培养24、48、72 h 后，每孔加入5 mg/mL MTT 溶液10 μL，置于CO2培养箱中培养4 h 后终止，DMSO（100 μL/孔）溶解紫色结晶。酶标仪检测每孔在490 nm 波长处的光密度（OD490），重复3 次，取平均值，计算增殖抑制率，公式为抑制率＝（1-给药组OD490/对照组OD490）×100%。

2.2 体内抗肝癌活性研究

2.2.1 模型建立 参考文献［14］报道。H22细胞复苏后在小鼠腹腔中培养，传2～3 代后在无菌条件下抽取腹水，生理盐水洗涤后离心，重复3 次，PBS 缓冲液稀释，0.2% 台盼蓝染色后当活细胞数大于95% 时，调整细胞浓度为5×106/mL，吸取浓度均匀的细胞悬液，以0.2 mL/只剂量皮下注射于小鼠右腋下。

2.2.2 分组与给药 称取藤茶总黄酮适量，加适量蒸馏水加热溶解，分别制成低剂量（30 mg/mL）、高剂量（120 mg/mL）混悬液；藤茶总黄酮固体脂质纳米粒冷冻干燥后，加适量蒸馏水均匀分散，分别制成低剂量（30 mg/mL）、高剂量（120 mg/mL）混悬液。

70 只小鼠适应性饲养5 d 后，随机分为空白组，模型组，阳性药组，藤茶总黄酮固体脂质纳米粒高、低剂量组，藤茶总黄酮高、低剂量组，每组10 只，除空白组外各组小鼠均于右腋下接种H22细胞造模。根据预实验结果，阳性药组小鼠腹腔注射3 mg/kg 环磷酰胺（0.2 mL/10 g），空白组、模型组小鼠灌胃给予生理盐水，藤茶总黄酮高、低剂量组，藤茶总黄酮固体脂质纳米粒高、低剂量组均分别按2.4、0.6 g/kg 剂量灌胃给予相应含药混悬液，各组小鼠每天给药1 次，连续10 d。每天称定小鼠体质量，观察其活动、毛发色泽、死亡等情况。最后1 次给药结束，小鼠禁食不禁水24 h 后处死，完整剥离腋窝皮下实体瘤，称定质量，计算抑瘤率，同时剖取胸腺、脾脏后称定质量，计算脏器指数，公式分别为抑瘤率＝（1-给药组肿瘤质量/模型组肿瘤质量）×100%、胸腺（或脾脏）指数＝胸腺（或脾脏）质量/小鼠体质量。

2.3 药动学研究

2.3.1 LC-MS/MS 条 件参考文献［15-16］报道。

2.3.1.1 色谱 Shim-pack XR-ODS Ⅲ色谱柱（75 mm×2.0 mm，1.6 μm）；流动相0.1%甲酸-乙腈（85∶15）；体积流量0.3 mL/min；柱温40 ℃；进样量1 μL。

2.3.1.2 质谱 负离子多级反应（MRM）模式；电喷雾离子源（ESI）；定量离子对，二氢杨梅素m/z319.15～193.20，二氢槲皮素m/z303.20～125.10；雾化气体积流量3.0 L/min；干燥气、加热气体积流量10.0 L/min；接口电压3.0 kV；接口温度 400 ℃；检测器电压 1.76 kV；CID 气230 kPa。

2.3.2 分组及给药 按“2.2.2”项下方法制备含药混悬液，藤茶总黄酮质量浓度为7.5 mg/mL。大鼠适应性饲养5 d 后，随机分为藤茶总黄酮组、藤茶总黄酮固体脂质纳米粒组，每组6 只，于实验前12 h 禁食，自由饮水，按150 mg/kg 剂量灌胃给药，于0.167、0.33、0.5、0.667、1、2、3、4、6、8、12、24 h 眼眶静脉丛釆血各0.5 mL，置于肝素钠处理的EP 管中，静置30 min，4 ℃下6 000 r/min离心15 min 分离血浆，-20 ℃下冷冻保存。

2.3.3 血浆样品处理 精密吸取“2.3.2”项下血浆100 μL 于离心管中，加入内标（二氢槲皮素）溶液10 μL，涡旋30 s，加入1% 甲酸乙腈（蛋白沉淀剂）190 μL，涡旋5 min，4 ℃下17 000 r/min离心15 min，取上清液，0.22 μm 微孔滤膜过滤，在“2.3.1”项条件下进样测定。

2.3.4 方法学考察

2.3.4.1 对照品、内标溶液制备 精密称取二氢杨梅素对照品、内标（二氢槲皮素）适量，置于100 mL 量瓶中，乙腈溶解定容，即得（两者质量浓度分别为50、30 μg/mL）。

2.3.4.2 专属性考察 取“2.3.4.1”项下对照品、内标溶液，以及按“2.3.3”项下方法处理的空白血浆、含药血浆样品溶液，在“2.3.1”项条件下进样测定，结果见图1。

图1 二氢杨梅素MRM 色谱图Fig.1 MRM chromatograms of dihydromyricetin

2.3.4.3 线性关系考察 精密吸取空白血浆90 μL，加入10 μL 对照品溶液，制成含二氢杨梅素1、5、10、20、50、100、200、500 ng/mL 的血浆样品溶液，按 “2.3.3”项下方法处理，在“2.3.1”项条件下进样测定。以溶液质量浓度为横坐标（X），二氢杨梅素、内标峰面积比值为纵坐标（Y）进行回归，得方程为Y＝0.004 3X-0.022 6（r＝0.999 6），在1～500 ng/mL 范围内线性关系良好，定量限（S/N＝10）为1 ng/mL。

2.3.4.4 精密度、准确度试验 制备含5、20、200 ng/mL 二氢杨梅素的血浆样品溶液，各平行3份，按“2.3.3”项下方法处理，在“2.3.1”项条件下进样测定，连续3 d，测得二氢杨梅素日内、日间精密度RSD 分别为0.25%～1.16%、0.67%～1.13%，准确度为95%～106%，均符合2015 年版《中国药典》规定的生物样品分析要求。

2.3.4.5 提取回收率、基质效应试验 制备含5、20、200 ng/mL 二氢杨梅素的血浆样品溶液，各平行3 份，按“2.3.3”项下方法处理，在“2.3.1”项条件下进样测定，记录峰面积A1；按“2.3.3”项下方法处理空白血浆后离心，上清液中加入相应质量浓度的对照品、内标溶液，在“2.3.1”项条件下进样测定，记录峰面积A2；用1%甲酸乙腈制成相同质量浓度的对照品、内标溶液，在“2.3.1”项条件下进样测定，记录峰面积A3，计算提取回收率、基质效应，公式分别为提取回收率＝A1/A2×100%、基质效应＝A2/A3×100%，测得两者分别为 81.86%～90.99%、86.63%～101.40%，均符合生物样品质量控制要求，表明二氢杨梅素受基质的影响较小。

2.3.4.6 稳定性试验 制备含5、20、200 ng/mL二氢杨梅素的血浆样品溶液，各平行3 份，按“2.3.3”项下方法处理后，分别在-80 ℃下反复冻融3 次、-20 ℃下冷冻保存15 d、室温（25 ℃）下放置12 h，在“2.3.1”项条件下进样测定。结果，二氢杨梅素峰面积RSD 为1.27%～6.49%，表明在上述保存条件下血浆样品稳定性均良好。

2.3.5 数据分析 绘制血药浓度-时间曲线，采用DAS 2.0 软件中的二房室模型计算主要药动学参数。

3 结果

3.1 对HepG2 细胞的抑制作用 图2 显示，藤茶总黄酮及其固体脂质纳米粒作用24、48、72 h 后，均对细胞增殖有较强的抑制作用，并呈浓度依赖性，其中 200 μg/mL 前者作用 72 h，50～200 μg/mL后者作用48、72 h 后的体外抑制率均达到80% 以上。另外，藤茶总黄酮IC50分别为163.63 μg/mL（24 h）、89.58 μg/mL（48 h）、49.44 μg/mL（72 h），而其固体脂质纳米粒分别为68.63 μg/mL（24 h）、39.99 μg/mL（48 h）、32.91 μg/mL（72 h），表明后者活性更显著。

图2 各样品对HepG2 细胞抑制率的影响Fig.2 Effects of various samples on the inhibitory rate of HepG2 cells

3.2 抗肝癌活性研究 表1～3 显示，与模型组比较，除藤茶总黄酮低剂量组外，各组对小鼠肿瘤的抑制作用比较，差异均有统计学意义（P＜0.01），而且纳米粒活性强于原料药；与空白组比较，模型组、阳性药组小鼠体质量均降低（P＜0.01），而藤茶总黄酮组、藤茶总黄酮固体脂质纳米粒组无明显变化（P＞0.05）；与空白组比较，阳性药组小鼠胸腺、脾脏指数降低（P＜0.05，P＜0.01），可能与环磷酰胺具有较强的免疫损失有关，而其他组无明显变化（P＞0.05）。

表1 各样品对小鼠肿瘤的影响（，n=10）Tab.1 Effects of various samples on tumors in mice（，n=10）

表1 各样品对小鼠肿瘤的影响（，n=10）Tab.1 Effects of various samples on tumors in mice（，n=10）

表2 各样品对小鼠体质量的影响（，n=10）Tab.2 Effects of various samples on the body weight of mice（，n=10）

表2 各样品对小鼠体质量的影响（，n=10）Tab.2 Effects of various samples on the body weight of mice（，n=10）

表3 各样品对小鼠免疫器官的影响（，n=10）Tab.3 Effects of various samples on immue organs in mice（，n=10）

表3 各样品对小鼠免疫器官的影响（，n=10）Tab.3 Effects of various samples on immue organs in mice（，n=10）

3.3 药动学研究 血药浓度-时间曲线见图3，相关数据经DAS 2.0 软件进行拟合后发现，藤茶总黄酮及其固体脂质纳米粒的体内药动学均符合二室模型。表4 显示，藤茶总黄酮固体脂质纳米粒组Cmax、Tmax、t1/2、AUC0～24h、AUC0～∞高于藤茶总黄酮组（P＜0.01），分别是后者的1.76、1.94、2.03、2.80、2.49 倍。

4 讨论

图3 各样品血药浓度-时间曲线Fig.3 Plasma concentration-time curves for various samples

表4 各样品主要药动学参数（，n=6）Tab.4 Main pharmacokinetic parameters for various samples（，n=6）

表4 各样品主要药动学参数（，n=6）Tab.4 Main pharmacokinetic parameters for various samples（，n=6）

本实验结果表明，藤茶总黄酮制成固体脂质纳米粒后可明显提高其抗肝癌作用，推测可能与该剂型可改善原料药与肿瘤细胞的亲和力［17］、具有良好的肿瘤靶向递送能力等优势有关。采用LC-MS/MS 法检测总黄酮主要成分二氢杨梅素的血药浓度，发现藤茶总黄酮制成纳米粒后该成分口服生物利用度显著提高，可能是由于纳米粒粒径小，比表面积大，可增加其与胃肠道黏膜的接触面积，从而促进药物有效吸收［18］。另外，该纳米粒能有效减缓二氢杨梅素体内消除，延长其t1/2，可能是药物被嵌入固体脂质基质骨架中而避免外界因素破坏，增加其稳定性，并可使其在体内缓慢释放，延长作用时间。

同时，藤茶总黄酮及其纳米粒口服给药后二氢杨梅素血药浓度很低，但其体内抗肝癌活性较好，产生这种低生物利用度、高药理活性现象的原因可能有（1）研究表明单次或长期大剂量连续口服二氢杨梅素时，其吸收量随剂量及给药时间增加而显著升高［19］，本实验给药剂量大（600、2 400 mg/kg），周期长（10 d），使其血药浓度同时具有剂量、时间上的叠加作用，从而发挥持久抑瘤活性［20］；（2）与健康大鼠比较，糖尿病模型大鼠中二氢杨梅素Cmax、AUC0～t、AUC0～∞等药动学参数均显著升高［21］，而本实验目前只考察了总黄酮及其纳米粒在正常大鼠体内的药动学，而二氢杨梅素在病理状态下的生物利用度可能会明显增加；（3）二氢杨梅素经胃肠道代谢后产生8 种代谢产物，经肠道吸收进入血液循环，或作用于肠道菌群，或直接刺激肠道免疫应答系统，从而发挥相应药效［22］；（4）二氢杨梅素口服后其血药浓度降低，可能在组织分布中较高［23］，尤其是制成固体脂质纳米粒后，纳米载体可使其具有明显的肝脏靶向性［24］。另外，本实验只测定了血浆中二氢杨梅素含有量，但其在肝、脾、肺中的含有量可能会明显升高，从而增强疗效，具体将在今后作进一步研究。