橙皮苷磷脂复合物固体分散体的制备、表征及其体内药动学研究

牛晓磊，贾润霞，谈秀凤

（1.郑州澍青医学高等专科学校，河南 郑州 450064；2.河南中医药大学第三附属医院，河南 郑州 450004；3.上海中医药大学，上海 201203）

橙皮苷是从陈皮等中药中提取、分离得到的黄酮类化合物，对妇科炎症［1-3］、子宫内膜癌［4］、子宫内膜异位症［5］、子宫癌［6］、卵巢癌［7］等均具有较好的疗效，但其水溶性、脂溶性均很差［8］，溶出度很低，导致体内口服困难［9］，从而限制了药效发挥。因此，促进橙皮苷体内吸收、提高其口服吸收生物利用度是扩大相关临床应用的关键。

磷脂复合物固体分散体近年来逐渐受到国内外医药研发人员的关注［10-13］，它实际上是磷脂复合物、固体分散体的联合使用，不仅可提高药物脂溶性（磷脂复合物），也能提高其水溶性（固体分散体），从而促进药物体内吸收，提高疗效［11］。因此，本实验制备了橙皮苷磷脂复合物固体分散体，并对其体外基本性质和体内药动学进行研究，以期为相关新型制剂的开发提供借鉴。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1100 型HPLC 色谱仪（配置DAD 检测器，美国Agilent 公司）；ZA305AS 型电子分析天平（上海赞维衡器有限公司）；JB-13 型磁力搅拌器（上海仪田精密仪器有限公司）；XD-5000A 型真空旋转蒸发仪（上海贤德实验仪器有限公司）；HY-5 型回旋振荡器（金坛市亿能实验仪器厂）；D8 型X 射线粉末衍射仪（德国布鲁克公司）；JN300-2 型氮气吹扫仪（吉米诺仪器公司）。

1.2 试剂与药物 橙皮苷原料药（批号180325，纯度95.4%，美国Mannstedt 公司）；橙皮苷对照品（批号110721-201818，纯度96.2%，中国食品药品检定研究院）；毛蕊异黄酮苷对照品（批号WK170618，纯度99.4%，成都瑞芬思生物科技有限公司）；聚乙烯吡咯烷酮（PVK K30，批号171101，河北科隆多科技有限公司）；大豆磷脂（批号DDT20180223，郑州豫和食品添加剂有限公司）。

1.3 动物 清洁级SD 大鼠，体质量250～280 g，购自河南省动物实验中心，动物生产许可证号SCXK（豫）2016-0001。

2 方法与结果

2.1 橙皮苷含有量测定（HPLC 法）

2.1.1 色谱条件 Diamonsil-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相1%乙酸-甲醇（35∶65）；体积流量1.0 mL/min；检测波长286 nm；柱温35 ℃。

2.1.2 方法学考察 精密称取10 mg 橙皮苷对照品于250 mL 量瓶中，甲醇超声溶解后定容至刻度，取适量用流动相制成10、5、1、0.1、0.05、0.01 μg/mL对照品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定。以溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，得方程为Y＝19.247 3X+1.267 4（r＝0.999 8），在0.01～10.0 μg/mL范围内线性关系良好。

取0.01、1、10 μg/mL 对照品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得橙皮苷日内、日间精密度RSD 均小于1.62%。取橙皮苷磷脂复合物固体分散体粉末约10 mg，置于100 mL量瓶中，甲醇超声溶解后定容至刻度，精密量取1 mL于10 mL 量瓶中，流动相定容至刻度，作为供试品溶液，取适量于0、4、8、12、24、48 h 在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得橙皮苷峰面积RSD 为0.62%，表明溶液在48 h 内稳定性良好。配制9 份空白磷脂-PVPK30 溶液，每份10 mL，加入 0.5、1.0、1.5 mL 对照品溶液（1 μg/mL）各3 份，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得橙皮苷平均加样回收率为99.14%～100.08%，RSD 为1.82%。

2.2 橙皮苷磷脂复合物固体分散体制备 将橙皮苷对照品置于45 ℃真空干燥箱中48 h 以除尽水分，取120 mg，与170 mg 大豆磷脂一同置于二氯甲烷中，55 ℃水浴中搅拌3 h 得澄清溶液，真空减压旋干至浅黄色残留物，即为磷脂复合物。取100 mg加到100 mL 无水乙醇中，振荡溶解后过0.22 μm微孔滤膜，加入400 mg PVP K30，55 ℃水浴中搅拌4 h 得澄清溶液，真空减压旋干至白色残留物，即得，粉碎后置于棕色干燥器中。平行制备3 批样品，测得橙皮苷平均质量分数为8.21%。

2.3 晶型分析 采用X 射线粉末衍射（XRPD），扫描条件为铜靶，扫描速度8°/min，管压40 kV，扫描范围3°～45°。取橙皮苷、辅料混合物（磷脂+PVP K30）、物理混合物（橙皮苷+磷脂+PVP K30）、橙皮苷磷脂复合物固体分散体适量，置于玻璃槽中，玻璃片压制平整后进行扫描，结果见图1。由此可知，橙皮苷主要以结晶状态存在，辅料混合物呈无定型状态，物理混合物仍可见橙皮苷典型结晶峰，而橙皮苷磷脂复合物固体分散体中橙皮苷由结晶型转变为无定型，表明该剂型制备成功。

图1 各样品XRPD 图Fig.1 XRPD spectra for various samples

2.4 表观溶解度测定 采用饱和溶剂法［13］。取过量橙皮苷、物理混合物、橙皮苷磷脂复合物固体分散体于水或正辛醇中，25 ℃下磁力搅拌48 h 后5 000 r/min离心10 min，取上清液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，结果见表1。由此可知，磷脂复合物固体分散体将橙皮苷在水、正辛醇中的溶解度分别提高了8.76、4.29 倍。

表1 各样品表观溶解度测定结果（μg/mL，，n=3）Tab.1 Results of apparent solubility determination of various samples（μg/mL，，n=3）

表1 各样品表观溶解度测定结果（μg/mL，，n=3）Tab.1 Results of apparent solubility determination of various samples（μg/mL，，n=3）

2.5 体外溶出度测定 取橙皮苷及其磷脂复合物固体分散体（含5 mg 橙皮苷）适量，空白溶出介质制成2 mL 混悬液，分别置于透析袋（分子量8 000～14 000 Da）中，固定于搅拌桨上，以900 mL 0.5% SDS 溶液为释放介质，37 ℃下100 r/min搅拌一段时间（保持总体积不变），搅拌结束后取适量溶液过0.45 μm 微孔滤膜，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，结果见图2。由此可知，橙皮苷12 h 内溶出度仅为18.63%，而其磷脂复合物固体分散体在3 h 内基本完全溶出。

图2 各样品体外溶出曲线Fig.2 In vitro dissolution curves for various samples

2.6 药动学研究

2.6.1 药液制备 分别取橙皮苷及其磷脂复合物固体分散体适量，加入0.5% CMC-Na 溶液，超声处理10 s，即得（质量浓度以橙皮苷计，均为8 mg/mL）。

2.6.2 分组、给药及采血 12 只大鼠禁食过夜后，随机分为橙皮苷组、橙皮苷磷脂复合物固体分散体组，每组6 只，灌胃给予“2.6.1 项下药液”，剂量均为80 mg/kg。乙醚麻醉大鼠后，于0.167、0.5、0.75、1、2、3、4、6、8、10、12 h 眼眶取血各0.3 mL（适当补充生理盐水），置于离心管中（加1～2 滴肝素浸润管壁），2 500 r/min 离心3 min，冷冻保存血浆样品。

2.6.3 内标溶液制备及血浆样品处理 参考文献［14］报道。称取10 mg 毛蕊异黄酮苷溶于50 mL甲醇中，甲醇再稀释至1 μg/mL 作为内标溶液。取“2.6.2”项下血浆样品100 μL、内标溶液50 μL，加入1.0 mL 乙腈涡旋3 min，室温下静置10 min 后8 000 r/min 离心5 min，分离有机相，氮气吹干，加入100 μL 甲醇复溶后密封待测。

2.6.4 线性关系考察 取橙皮苷对照品适量，甲醇制成10.0、5.0、2.5、1.0、0.1 μg/mL 溶液，各取100 μL，氮气吹干后加入100 μL 空白血浆溶解，按“2.6.3”项下方法处理后在“2.1.1”项色谱条件下进样20 μL 测定。以溶液质量浓度为横坐标（X），橙皮苷、内标（毛蕊异黄酮苷）峰面积比值为纵坐标（Y）进行回归，得方程为Y＝0.101 4X+0.298 4（r＝0.992 3），在0.1～10.0 μg/mL范围内线性关系良好。

2.6.5 方法学考察 取“2.6.2”项下血浆样品，于0、2、4、6、8、10、12 h 在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得橙皮苷峰面积RSD 为9.92%，表明溶液在12 h 内稳定性良好。取“2.6.4”项下10.0、5.0、0.1 μg/mL 对照品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定6 次，测得橙皮苷峰面积RSD 分别为2.31%、4.76%、6.14%，表明仪器精密度良好。取“2.6.4”项下5.0、2.5、1.0 μg/mL 对照品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定9 次，测得橙皮苷加样回收率为90.22%～95.19%，RSD 为10.16%。将仅含橙皮苷的血浆样品（0.1 μg/mL）逐步稀释，以S/N＝10 为定量限，S/N ＝3 为检测限，测得两者分别为12、5 ng/mL。

2.6.6 结果分析 血药浓度-时间曲线见图3，相关数据通过DAS2.0 软件进行处理，并采用非房室模型计算主要药动学参数，结果见表2。由此可知，磷脂复合物固体分散体t1/2、Cmax、AUC0～t、AUC0～∞高于原料药（P＜0.05，P＜0.01），Tmax无明显变化（P＞0.05），相对生物利用度提高至2.54 倍。

图3 各样品血药浓度-时间曲线Fig.3 Plasma concentration-time curves for various samples

3 讨论与结论

对于生物药剂学分类系统（BCS）Ⅳ药物来说，提高其水溶性、脂溶性有助于解决吸收瓶颈［15-17］。本研究发现，磷脂复合物固体分散体将橙皮苷在水、正辛醇中的溶解度分别提高了8.76、4.29 倍，同时增加了其溶出率及累积溶出度，可为改善其生物利用度奠定了基础。

表2 各样品主要药动学参数（，n=6）Tab.2 Main pharmacokinetic parameters for various samples（，n=6）

表2 各样品主要药动学参数（，n=6）Tab.2 Main pharmacokinetic parameters for various samples（，n=6）

体内药动学研究结果显示，磷脂复合物固体分散体可降低药物体内消除速度，导致其t1/2显著延长，在其他研究中也有类似报道［18-19］；Cmax提高了2.27 倍，生物利用度提高至2.54 倍，表明它能显著促进药物体内吸收；Tmax无明显变化，可能是由于磷脂复合物一般可使该参数延后［20-21］，而固体分散体一般可使其提前［13］，两者联用后上述作用恰好相互抵消。另外，橙皮苷在体内还会受到肠道内各种代谢酶、肠道菌群、水解、外排转运载体等因素的影响，最终会制约其生物利用度的提高程度［22］。

综上所述，本研究制备的橙皮苷磷脂复合物固体分散体溶解性、生物利用度良好，有利于后续进一步相关研究（如片剂、胶囊等），从而为临床提供一种安全、有效的妇科用药。