蛋白桑叶多酚提取工艺的优化及其抗氧化、抑菌活性

陈向阳 ，穆爱洁，汪蒙蒙，付婕妤，陈永霞，王卫东，吴永祥*

（1.黄山学院生命与环境科学学院，安徽 黄山 245041；2.黄山祁弘韵蛋白桑农业科技有限公司，安徽 黄山 245612；3.黄山峰源生物科技有限公司，安徽 黄山 245600）

蛋白桑Morus albaL.又称饲料桑，是我国经过长期选育、改良、优化的新型品种，具有区域适应性和抗逆性强、产量高等优点，已在许多地区得到大力推广［1］。桑叶主要化学成分包括多糖、生物碱、多酚、黄酮等［2-3］，具有抗氧化、抗炎、降血糖、抑制胰脂肪酶等多种生物活性［4-6］，其中多酚是一种非常重要的次生代谢产物［7］，目前已有关于该成分提取工艺的报道［8-10］。但目前国内外学者都是基于单一的溶剂法或超声法提取蛋白桑叶多酚，尚未利用表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS）的增溶作用来协同超声提取，而且缺少药理作用的研究。因此，本实验优化蛋白桑叶多酚的提取工艺，并评价其抗氧化、抑菌活性，以期为该资源综合开发利用提供依据。

1 材料

1.1 试剂与药物 蛋白桑叶由黄山祁弘韵蛋白桑农业科技有限公司提供，于2018 年10 月采自安徽省祁门县闪里镇，经黄山学院生命与环境科学学院胡长玉教授鉴定为桑属桑科植物蛋白桑Morus albaL.的叶。福林酚试剂、十二烷基硫酸钠（SDS）、丹宁酸、维生素C、DPPH、ABTS 等（美国Sigma 公司）；蛋白胨、牛肉膏、琼脂（北京陆桥技术股份有限公司）。

1.2 仪器 SQ510C 型高压灭菌器（重庆雅马拓科技有限公司）；SpectraMax-190 型全波长酶标仪（美国Molecular Devices 公司）；SCQ-5201C 型数控加热功率可调型超声波清洗器（上海声彦超声波仪器有限公司）。

2 方法与结果

2.1 多酚提取物制备 取干燥蛋白桑叶粉末2.0 g，按照1∶15 料液比加入0.6%SDS、60%乙醇，调节超声温度50 ℃，超声功率200 W，超声时间10 min，将提取液置于离心管中，3 000 r/min离心15 min，取上清液浓缩，即得。

2.2 多酚含有量测定 参考文献［11］方法，并作适当修改。精密配制25、50、75、100、150 μg/mL单宁酸对照品溶液，各取0.05 mL，与0.05 mL 福林酚试剂（0.25 mol/L）一同置于1.75 mL离心管中混合反应3 min，加入1 mL 碳酸钠溶液（0.7 mol/L），室温下静置1 h 后显色，精密吸取0.2 mL 反应液，置于酶标仪上，在750 nm 波长处测定吸光度。以溶液质量浓度为横坐标（X），吸光度为纵坐标（A）进行回归，得方程为A＝0.001 7X+0.006 8（R2＝0.998 0），在25～150 μg/mL范围内线性关系良好。根据上述方程，测定多酚含有量。

2.3 单因素试验

2.3.1 SDS 用量 固定乙醇体积分数60%、料液比1∶15、超声温度50 ℃、超声功率200 W、超声时间10 min，考察SDS 用量0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%对多酚含有量的影响，结果见图1。由此可知，SDS 用量小于0.4%时多酚含有量随着其增加而升高，在0.4% 时达到最大值，为（11.49±0.04）mg/g，与未加SDS 比较差异具有统计学意义（P＜0.05）；SDS 用量大于0.4%时多酚含有量反而略有降低，可能是其达到临界胶束浓度后对该成分增溶作用的影响不大，但对其他杂质影响较明显［12］。因此，选择 SDS 用量为0.2%～0.6%。

图1 SDS 用量对多酚含有量的影响Fig.1 Effects of SDS consumption on polyphenols content

2.3.2 超声功率 固定乙醇体积分数60%、料液比1∶15、SDS 用量0.6%、超声温度50 ℃、超声时间10 min，考察超声功率100、150、200、250、300、350 W 对多酚含有量的影响，结果见图2。由此可知，超声功率100～250 W 时多酚含有量随着其增加而升高，在250 W 时达到最大值，为（11.28±0.20）mg/g，与100、150、200 W 比较差异具有统计学意义（P＜0.05）；超声功率大于250 W时多酚含有量反而呈降低趋势，可能是功率过高会使该成分发生分解［13］。因此，选择超声功率为200～300 W。

图2 超声功率对多酚含有量的影响Fig.2 Effect of ultrasonic power on polyphenols content

2.3.3 超声温度 固定乙醇体积分数60%、料液比1∶15、SDS 用量0.6%、超声功率200 W、超声时间10 min，考察超声温度30、40、50、60、70、80 ℃对多酚含有量的影响，结果见图3。由此可知，提取温度60 ℃时多酚含有量达到最大值，为（11.07±0.08）mg/g，与30、40、50 ℃比较差异具有统计学意义（P＜0.05）；提取温度高于60 ℃时多酚含有量反而明显降低（P＜0.05），可能是高温会影响超声空化效果，而且可引起该成分发生分解［14］。因此，选择超声温度为50～70 ℃。

图3 超声温度对多酚含有量的影响Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on polyphenols content

2.3.4 超声时间 固定乙醇体积分数60%、料液比1∶15、SDS 用量0.6%、超声温度50 ℃、超声功率200 W，考察超声时间5、10、15、20、25 min对多酚含有量的影响，结果见图4。由此可知，超声时间5～15 min 时多酚含有量随着其延长而升高，在15 min 时达到最大值，为（10.47±0.23）mg/g，与5、10 min 比较差异具有统计学意义（P＜0.05）；超声时间大于15 min 时多酚含有量反而略有降低，可能是长时间超声振动会破坏该成分结构［15］。因此，选择超声时间为15 min，并且不进行后续考察。

图4 超声时间对多酚含有量的影响Fig.4 Effect of ultrasonic time on polyphenols content

2.3.5 乙醇体积分数 固定料液比1∶15、SDS用量0.6%、超声温度50 ℃、超声功率200 W、超声时间10 min，考察乙醇体积分数40%、50%、60%、70%、80%对多酚含有量的影响，结果见图5。由此可知，乙醇体积分数40%～50%时多酚含有量随着其增加而升高，在50% 时达到最大值，为（10.73±0.11）mg/g，与40%比较差异具有统计学意义（P＜0.05）；乙醇体积分数大于50%时多酚含有量反而降低，可能是乙醇体积分数过高会使蛋白质等大分子变性沉淀，阻碍该成分从组织细胞向溶剂的扩散［16］。因此，选择乙醇体积分数为40%～60%。

图5 乙醇体积分数对多酚含有量的影响Fig.5 Effect of ethanol concentration on polyphenols content

2.3.6 料液比 固定乙醇体积分数60%、SDS 用量0.6%、超声温度50 ℃、超声功率200 W、超声时间10 min，考察料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 对多酚含有量的影响，结果见图6。由此可知，料液比为1∶25 时多酚含有量达到最大值，为（13.58±0.05）mg/g，与1∶10、1∶15、1∶20 比较差异具有统计学差异（P＜0.05），表明随着溶剂用量升高该成分与溶剂的接触面积增加，有利于其溶出，而扩散达到平衡后提取量不再升高［17］。因此，从浓缩成本考虑，选择料液比为1∶25，并且不进行后续考察。

图6 料液比对多酚含有量的影响Fig.6 Effect of solid-liquid ratio on polyphenols content

2.4 响应面法 在单因素试验基础上，选择SDS用量（A）、超声功率（B）、超声温度（C）、乙醇体积分数（D）作为影响因素，多酚含有量（Y）作为评价指标，采用4 因素3 水平响应面法优化提取工艺。因素水平见表1，结果见表2。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

对表2 数据进行拟合，得到多元回归方程为Y＝15.41-0.36A+0.16B+0.12C-0.12D+0.27AB+0.20AC-0.30AD+0.31BC+0.28BD+0.15CD-0.54A2-0.32B2-0.74C2-0.44D2，方差分析见表3。由此可知，模型P＜0.000 1，表明模型达到极显著水平；失拟项P＞0.05，表明未知因素对结果影响较小；R2为0.916 8，为0.833 6，表明模型拟合程度良好；变异系数为1.65%，表明该模型重复性、可靠性理想；因素A、B、AB、AD、BC、BD、A2、B2、C2、D2均达到显著（P＜0.05）或极显著（P＜0.05）水平。响应面分析见图7。

表2 试验设计与结果Tab.2 Design and results of tests

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

图7 各因素响应面图Fig.7 Response surface plots for various factors

由此得到，最优提取工艺为SDS 用量0.34%，超声功率259.92 W，超声温度60.89 ℃，乙醇体积分数50.33%，多酚质量分数为15.48 mg/g，考虑到生产操作的实际情况，将其修正为SDS 用量0.34%，超声功率250 W，超声温度60 ℃，乙醇体积分数50%。按照上述优化工艺进行验证试验，测得多酚质量分数为（15.11±0.21）mg/g，与预测值15.48 mg/g 接近（相对误差为2.45%），表明模型预测性良好。

2.5 还原能力 参考文献［18］报道，并作适当修改。取0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mg/mL 提取液各50 μL，与1%铁氰化钾溶液、pH 6.6 磷酸缓冲液各50 μL 混合，置于50 ℃水浴锅中反应20 min后取出，冷却，加入10% 三氯乙酸50 μL，3 000 r/min 离心15 min，取上清液90 μL，加入蒸馏水100 μL、0.1%三氯化铁10 μL，静置10 min，在700 nm 波长处测定吸光度，以维生素C 为阳性对照，蒸馏水为空白对照，重复3 次，取平均值，结果见表4。由此可知，多酚还原能力与其质量浓度呈正相关（P＜0.05），IC50为0.116 mg/mL。

表4 多酚还原能力测定结果（，n=3）Tab.4 Results of reducing capacity determination of polyphenols（，n=3）

表4 多酚还原能力测定结果（，n=3）Tab.4 Results of reducing capacity determination of polyphenols（，n=3）

注：同列不同字母表示相应数据之间的差异具有统计学意义（P＜0.05）。

2.6 ABTS 自由基清除能力 参考文献［19］报道，并作适当修改。将2.45 mmol/L 过硫酸钾与7 mmol/L ABTS 自由基等量混匀后，静置于暗处16 h，乙醇稀释ABTS 自由基溶液直至在734 nm 处的吸光度为0.70±0.02，作为使用液。取0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL 提取液各50 μL、使用液100 μL，混匀后避光反应5 min，在734 nm波长处测定吸光度Ai；将100 μL 使用液与50 μL蒸馏水混匀，5 min 后在734 nm 波长处测定吸光度A0；将100 μL 乙醇与0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL 提取液各50 μL 混匀，静置5 min，在734 nm 波长处测定吸光度Aj，以维生素C 为阳性对照，重复3 次，计算清除率，公式为清除率＝［（A0-Ai+Aj）/A0］×100%，结果见表5。由此可知，多酚清除能力与其质量浓度呈正相关（P＜0.05），IC50为0.014 mg/mL。

表5 多酚清除能力测定结果（，n=3）Tab.5 Results of scavenging capacity determination of polyphenols（，n=3）

表5 多酚清除能力测定结果（，n=3）Tab.5 Results of scavenging capacity determination of polyphenols（，n=3）

注：同列不同字母表示相应数据之间的差异具有统计学意义（P＜0.05）。

2.7 抑菌活性 采用滤纸片扩散法［20-21］。在培养基中加入含有大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、普通变形杆菌、枯草芽孢杆菌、绿脓杆菌的菌悬液各100 μL，涂布均匀，在直径6 mm 的滤纸片中央加入10 μL 提取液，以二甲基亚砜为空白对照，对羟基苯甲酸丙酯为阳性对照，37 ℃下倒置培养24 h 后测定抑菌圈直径。同时，将提取液依次稀释至0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mg/mL，参照文献［22］报道的方法观察抑菌圈，将首次出现抑菌圈所对应的提取液质量浓度作为最低抑菌浓度（MIC），结果见表6。由此可知，在0.05～0.8 mg/mL 质量浓度范围内，多酚对5种细菌的抑制作用呈量效关系（P＜0.05），对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的MIC 均为0.2 mg/mL，而对普通变性杆菌、绿脓杆菌的MIC均为0.4 mg/mL。

表6 多酚抑菌活性测定结果（，n=3）Tab.6 Results of anti-bacterial activity determination of polyphenols（，n=3）

表6 多酚抑菌活性测定结果（，n=3）Tab.6 Results of anti-bacterial activity determination of polyphenols（，n=3）

注：同列不同字母表示相应数据之间的差异具有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

本实验采用响应面法优化蛋白桑叶多酚提取工艺，测得多酚质量分数高达15.11 mg/g，较未添加SDS 提高了59.83%。代燕丽等［9］通过响应面法对上述工艺进行了优化，多酚得率提高了约38.8%，但仍低于本实验结果，表明SDS 能显著提高提取效率。

抗氧化实验结果显示，蛋白桑叶多酚具有显著的还原能力，能有效清除ABTS 自由基，并与其质量浓度呈显著正相关。吴黉坦等［23］对金边桑叶多酚提取物的抗氧化作用进行了研究，发现其水提物对ABTS 自由基具有较强的清除能力，IC50值为41.25 μg/mL，高于本实验的14 μg/mL，表明SDS协同超声提取能较好地保留其抗氧化活性。抑菌实验结果显示，蛋白桑叶多酚对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、普通变形杆菌、枯草芽孢杆菌、绿脓杆菌均具有较好的抑制作用，并呈明显的剂量依赖性，高欣妍等［24］发现桑叶乙醇提取物对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌均具有一定抑制作用，MIC 为0.3 mg/mL，高于本实验的0.2 mg/mL，表明优化工艺能显著增强上述活性。由此可知，加入表面活性剂SDS 协同超声提取时，能较好地改善蛋白桑叶多酚的抗氧化、抑菌活性。