基于群体感应抑制剂的香芹酚与鱼精蛋白复合对冷藏大菱鲆的保鲜作用

李婷婷 刘 楠 马 堃 王 轰 王明丽 孙盛娟 孙大鹏 励建荣*

（1 大连民族大学 生物技术与资源利用教育部重点实验室 辽宁大连116600 2 渤海大学食品科学与工程学院 辽宁省食品安全重点实验室 辽宁锦州121013 3 蓬莱京鲁渔业有限公司 山东烟台264010）

大菱鲆（Scophthalmus maximus），多称为多宝鱼（Turbot），也叫瘤棘鲆，自1992年引进山东沿海地区，是海水养殖的重要鱼类[1]。然而，其即使在冷藏条件下仍易变质[2]。目前，相关研究已证实细菌群体感应（Quorum sensing，QS）对众多食品致腐因素（如蛋白质、脂肪、壳多糖等分解酶）的活性均有调控作用[3]。群体感应抑制剂是通过干扰细菌间的信息交流，阻碍调控腐败基因的表达，最终起到防腐保鲜的效果。这种通过抑制QS 系统的保鲜策略，为今后食品腐败机制的研究及食品保鲜技术的开发提供了一条新思路。本实验室研究人员前期从腐败的冷藏大菱鲆优势腐败菌中成功分离出1 株荧光假单胞菌（Pseadomonas fluorescens）PF-08，该菌具有群体感应现象，经试验验证香芹酚对其QS 现象具有抑制作用。

香芹酚 （Carvacrol） 是一种天然草本源化合物，多存在于百里香、牛至、东紫苏、小鱼仙草、香茶菜等中草药中。Myszka 等[4]研究表明百里香精油具有抑制荧光假单胞菌KM121 群体感应及相关毒力因子表达的效果。鱼精蛋白（Protamine）是一种常见的抗菌类物质[5]。1937年，鱼精蛋白的抑菌效果首次被报道[6]，国内外科研人员对鱼精蛋白的抑菌机理做了深入研究。目前，鱼精蛋白作为天然食品防腐剂已成功应用于食品贮藏保鲜过程中。鱼精蛋白可有效破坏细菌细胞膜，从而改变细胞渗透功能，最终达到抑菌的目的[7]。徐晨等[8]探究了不同配比壳聚糖-鱼精蛋白复合液对冷藏草鱼片的保鲜效果，结果显示0.8%鱼精蛋白溶液和1%壳聚糖复配能够有效延长草鱼的货架期。

本试验以大菱鲆无菌鱼片为研究对象，以感官评分、菌落总数、水分分布状态、质构、TVB-N值、TBA 值、K 值及pH 值作为检测指标，探讨香芹酚与鱼精蛋白结合对荧光假单胞菌的协同抑制效果，为今后群体感应抑制剂的研究开发，以及在水产品贮藏保鲜工业生产中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与菌种

鲜活养殖大菱鲆，（0.5±0.2）kg，当地水产市场；香芹酚，晶纯生化科技；鱼精蛋白（食品级），中国河南博雅生物公司；紫色杆菌（Chromobacterium violaceum）CV026、荧光假单胞菌PF-08（冷藏大菱鲆中分离），均为本实验室保存。

1.2 试剂

平板计数营养琼脂、LB 肉汤，青岛高科园海博生物技术有限公司；三氯乙酸、硼酸、氢氧化钾、硫代巴比妥酸、磷酸二氢钾、高氯酸、磷酸氢二钾均为分析纯级试剂，天津科密欧化学试剂有限公司。

1.3 仪器与设备

CR-400 型色彩色差计，杭州祥盛科技有限公司；FE20 型pH 计，上海梅特勒-托利多公司；PEN3 型电子鼻，德国AIRSENSE 公司；Agilent-1200 高效液相色谱仪，美国Agilent 公司；FOSS凯氏定氮仪，丹麦福斯公司；TA.XT-plus 质构仪：英国table Micro System 公司；NMI20 核磁共振分析仪，上海纽迈电子科技有限公司；UV-2550 紫外-可见分光光度计，上海尤尼柯仪器有限公司；Biofuge stratos 台式离心机，美国Thermo Fisher公司。

1.4 试验方法

1.4.1 香芹酚QS 抑制活性的验证

1.4.1.1 香芹酚最小抑菌浓度（MIC）测定 采用牛津杯打孔法，将活化的紫色杆菌CV026 和荧光假单胞菌PF-08 以1%的接种量分别接种到已冷却至40 ℃的LB 营养琼脂培养基中，混合均匀，使用牛津杯打孔，倒板待凝固后，二倍稀释法向各孔中依次加入0～32 μL/mL 不同浓度的香芹酚，28 ℃静置培养24～36 h。测定样品产生的抑菌圈直径。

1.4.1.2 报告平板法检测香芹酚QS 抑制活性将过夜活化完成的CV026 加入含20 μg/mL 卡那霉素的LB 肉汤内扩大培养，适当培养后于LB 琼脂（含有20 μg/mL C6-HSL）中混匀，所制培养板打孔。待培养基凝固后，向孔中加入200 μL 0.125 μL/mL 的香芹酚，28 ℃静置培养24～48 h，观察紫色菌素的产生情况，50%甲醇为对照。

1.4.2 原料预处理

1.4.2.1 荧光假单胞菌PF-08 菌悬液的制备 将过夜活化完成的荧光假单胞菌PF-08 接种至LB肉汤中，28 ℃扩大培养24 h，6 500×g 离心5 min，菌体稀释至OD600＝0.6。将制备好的菌悬液于4 ℃冰箱内贮藏，备用。麦氏比浊管用作校对细胞浓度，具体配比见表1。

表1 麦氏比浊管配比Table 1 The ratio of mcintosh turbidimetric tube

1.4.2.2 无菌鱼片的制备 根据Herbert 等[9]的方法将鲜活的大菱鲆碎冰致死，去除其内脏、鱼头及鱼皮后，片取鱼肉，使用无菌水清洗后用滤纸吸干水分，喷撒75%的酒精杀菌，并在酒精灯上方烤2～3 s，测定鱼块的菌落总数，若低于102CFU/g，无菌鱼片则制作成功。

1.4.2.3 接种与贮藏试验 将接种荧光假单胞菌菌悬液的鱼片平均分为4 组，分别浸泡于无菌水（A 组）、含有0.125 μL/mL 香芹酚（B 组）、0.2%鱼精蛋白（C 组）以及0.125 μL/mL 香芹酚和0.2%鱼精蛋白（D 组）中，1 min 后取出，使用无菌滤纸将鱼片表面的菌液吸干，装袋，（180±20）g/袋，于（4±0.2）℃冰箱内贮存，每隔2 d 取鱼块进行理化等指标测定。

1.4.3 检测方法

1.4.3.1 感官评定 参考高昕等[10]的方法稍加修改，感官评定小组由6 位经过专业训练的感官评定人员（男女比例1∶1）构成，从色泽、气味、肌肉形态、肌肉弹性4 个方面进行评价，具体评价标准见表2。

感官评分值=色泽得分×20%+气味得分×30%+肌肉形态得分×30%+肌肉弹性得分×20%，感官评分低于5 分被视为不可接受。

表2 感官评价标准Table 2 Sensory evaluation

1.4.3.2 菌落总数的测定 菌落总数参考GB 4789.2-2010 《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》，采用稀释平板计数法测定。

1.4.3.3 挥发性盐基氮（TVB-N）的测定 鱼片贮藏期挥发性盐基氮（TVB-N）根据GB/T 5009.44-2003 微量扩散法测定。

1.4.3.4 硫代巴比妥酸（TBA） 的测定 参考Siu等[11]的方法，称取10 g 肉样，加入适量体积分数5%的TCA 溶液后均质过滤。取5 mL 上清液与5 mL 0.02 mol/L 的TBA 溶液混合并于（80±1）℃恒温水浴中加热40 min，观察颜色变化。冷却后于532 nm 波长下测定吸光度。

1.4.3.5 K 值的测定 参照Özogul 等[12]的方法，略作修改。称取5 g 绞碎的鱼肉，加入25 mL 0.6 mol/L 高氯酸溶液，均质，于4 ℃，1 940×g 条件下离心10 min。取上清液，使用1 mol/L 的KOH 溶液将pH 值调到6.5～6.8 后2 次离心。离心后过滤保留上清液，-80 ℃贮藏上机备用。

冻存液解冻后过0.45 μm 无机滤膜过滤，上机检测。高效液相色谱条件：色谱柱ODS C18（250 mm×4.6 mm）；流动相：0.06 mol/L K2HPO4和0.04 mol/L KH2PO4混和液；进样量：1 μL；柱温：37℃；紫外检测器波长：254 nm，液相流速：1 mL/min。结果按式（1）计算。

式中，HxR——次黄嘌呤核苷；Hx——次黄嘌呤；ATP——三磷酸腺苷；ADP——二磷酸腺苷；AMP——腺苷酸；IMP——肌苷酸；以上均以浓度表示，单位为μmol/g。

1.4.3.6 pH 值的测定 准确称取10.0 g 样品于含有超纯水90 mL 的样品杯中，6 000 r/min 均质过滤。所得样液静置30 min 后测定。

1.4.3.7 质构特性的测定 参照Cai 等[13]的方法，将鱼肉切成小块（1.5 cm×1.5 cm×1.0 cm），使用P/50 探头对样品进行2 次TPA 分析，测定参数：测前速率35 mm/s，速度1 mm/s，恢复2 s，压缩程度50%，停留间隔时间5 s，触发力5 g。

1.4.3.8 水分分布的测定 参照Finch 等[14]的方法，将鱼肉切成大小为1.0 cm×1.0 cm×2.0 cm 立方块，称量、记重，放于核磁管底部。使用低场核磁测定其水分分布。相关仪器参数设置如下：磁场强度0.5 T，τ 值（90°～180°脉冲）110 μs，重复间隔TR 2 000 ms，接收信号光子数4 500，重复采样NS 为16，回波数为10 000，质子共振频率22.6 MHz，温度32 ℃，弛豫时间用CPMG 序列测定。

1.4.4 数据分析 所有试验均设置3 次平行，使用Orign 2015 及EXCEL 2003 软件作图及数据统计分析，用SPSS 12.0 软件进行方差分析（Analysis of variance，ANOVA），差异显著水平设置为P<0.05；用电子鼻WinMuster 软件对不同贮藏时间下大菱鲆片的挥发性气味进行分析。

2 结果与分析

2.1 香芹酚的最小抑菌浓度（MIC）值

试验结果显示，香芹酚对CV026（紫色杆菌）和PF-08（荧光假单胞菌）的MIC 分别为0.25 μL/mL 和4 μL/mL。为保证试验效果不是由香芹酚抑菌作用所致，以下试验所用的香芹酚浓度均低于MIC。

2.2 报告平板法检测香芹酚群体感应抑制活性

QS 现象调控CV026 紫色素的生成，如果香芹酚具有群体感应抑制效果，将会抑制CV026 产紫色，在孔径周围会出现不透明的抑制圈，抑制圈的直径越大，其抑制活性越高。亚抑菌浓度（0.125 μL/mL）下，香芹酚对紫色杆菌CV026 群体感应抑制活性的影响结果如图1所示。添加香芹酚的孔径周围出现了白色、不透明、浑浊的抑制圈，表明香芹酚可抑制CV026 紫色素的生成，具有良好的群体感应抑制活性。

2.3 感官评定分析

本文对不同处理组大菱鲆鱼片4 ℃贮藏下的感官品质进行评估，结果如图2所示，随贮藏时间的延长，4 组鱼片的感官评分值均呈下降趋势，且D 组的感官评分始终高于其余3 组。如图所示，4组鱼片的初始评分均为10，表明初始时大菱鲆鱼片处于完全新鲜状态，而低于5 分则代表鱼片已不可食用。A 组在贮藏第6 天时感官评分为4.87，鱼鲜味消失，出现腥臭味，肉质松散、无弹性，超出消费者可接受范围，而其余处理组（B，C，D 组）的感官评分分别为7.56，8.08 和8.77，处于较好品质。B，C，D 组分别于第9 天（4.83）、第12 天（4.66）、第15 天（4.62）达到不可食用状态，说明香芹酚处理能够在一定程度上改善大菱鲆鱼片的感官品质，而香芹酚与鱼精蛋白复合对延缓大菱鲆感官品质的劣变效果最优。

图1 香芹酚对紫色杆菌CV026 的QS 抑制活性Fig.1 The QS inhibitory effect of carvacrol on Chromobacterium violaceum CV026

2.4 菌落总数分析

菌落总数是判断食品腐败程度的重要指标之一[15]，微生物的繁殖是导致大菱鲆在贮藏过程中发生质变的主要原因。如图3所示，4 组鱼片的初始菌落总数为3.36 lg（CFU/g），这与菌株PF-08 接种的浓度和时间有关。在贮藏期间4 组鱼片的菌落总数均呈上升趋势，A 组和B 组的菌落总数没有明显变化，表明香芹酚并没有抑制细菌的生长，而是通过干扰细菌中调控致腐因子的QS 系统，使其致腐能力大幅度降低，从而起到延长货架期的效果。而使用鱼精蛋白（C 组）及鱼精蛋白-香芹酚（D 组）处理鱼片其菌落总数均低于对照组，说明鱼精蛋白具有一定抑菌作用，而香芹酚与鱼精蛋白复配（D 组）的效果最优，这是由于鱼精蛋白与香芹酚不同的作用机制发挥了协同增效作用，这与李学鹏等[16]的研究结果相一致，该研究采用茶多酚与具有群体感应抑制效果的丹皮提取物复配，研究冷藏大菱鲆鱼片的保鲜效果，发现复配组的菌落总数均低于其余3 组，且丹皮提取物处理组菌落总数的生长趋势与对照组相似，并不抑制细菌的生长。

图2 不同处理组的大菱鲆鱼片在4 ℃冷藏条件下感官评分的变化Fig.2 Sensory changes of different treated turbot fillets during storage at 4 ℃

图3 不同处理组的大菱鲆鱼片在4 ℃冷藏条件下菌落总数的变化Fig.3 TVC changes of different treated turbot fillets during storage at 4 ℃

2.5 TVB-N 值分析

在贮藏过程中水产品或其它动物性食品的蛋白在内源性酶和微生物的共同作用下，逐步分解产生二甲胺、三甲胺、氨和乙胺等挥发性碱性物质，并在体内积累，其积累量被称为挥发性盐基氮（TVB-N）[17]。目前TVB-N 已被世界上多数国家认为是判定水产品腐败质变的关键指标[18]。参照GB/T 18108-2008 标准，海水鱼TVB-N 值低于13 mg/100 g 为一级鲜度；TVB-N 值处于13～30 mg/100 g 为合格品；高于30 mg/100 g 则不可食用[19]。图4为大菱鲆鱼片在冷藏条件下TVB-N 值的变化，初始值为8.46 mg/100 g，处于一级鲜度，随着贮藏时间的延长，4 组鱼片的TVB-N 含量逐渐上升，其增长速率依次为空白组＞香芹酚处理组＞鱼精蛋白处理组＞混合（香芹酚＋鱼精蛋白）处理组。样品贮藏第6 天时，A 组（即对照组）的TVB-N 值为32.67 mg/100 g，已超出合格范围，而B，C，D 组的TVB-N 值分别为23.67，19.47，15.55 mg/100 g，处于二级鲜度范围。不同处理对冷藏大菱鲆鱼片TVB-N 的影响效果依次为D>C>B>A，可以看出鱼精蛋白的保鲜效果好于香芹酚，而复配处理的保鲜效果优于二者单独使用的效果。可见，香芹酚处理组相比于对照组，可延长冷藏大菱鲆货架期约2～3 d，复配保鲜组相比于对照组可延长货架期6～7 d。由此可知，鱼精蛋白与香芹酚复配保鲜能够有效降低大菱鲆鱼片在贮藏过程中挥发性盐基总氮的产生量，达到延长货架期的目的。这可能与鱼精蛋白、香芹酚的协同作用有关。贮藏前期荧光假单胞菌的生长被鱼精蛋白抑制，随着贮藏时间的延长，微生物数量逐渐增多，贮藏中后期，菌株达到一定浓度时，香芹酚可通过阻碍细菌的QS 系统，降低产蛋白酶的能力，从而延缓TVB-N 值的上升。

2.6 TBA 值分析

硫代巴比妥酸（TBA）是衡量鱼和鱼肉产品脂肪氧化程度的重要指标，脂肪氧化的主要原因是自动氧化和脂肪酶水解[20]。相关研究表明，鱼体的脂肪氧化程度与脂肪含量、贮藏温度以及鱼的种类等诸多因素有关。如图5所示，冷藏大菱鲆鱼片的初始TBA 值为0.52 mg/kg，而后4 组样品的TBA 值均呈先上升后下降的趋势。这是由于随贮藏时间的延长，鱼肉中的脂肪氧化程度逐渐增大，其产物丙二醛含量上升，丙二醛可以与鱼体内的其它成分，如氨基酸、核酸、蛋白质及醛类等物质发生反应。贮藏前期，脂肪氧化产物丙二醛含量显著高于丙二醛的消耗量，因此呈上升趋势，贮藏中后期大量脂肪已被氧化，丙二醛产生量降低，从而导致总浓度降低，呈下降趋势[21]。4 组样品中的空白组在贮藏第6 天时丙二醛含量达到峰值，试验组的峰值时间推后，这表明香芹酚、鱼精蛋白及其复合液能够抑制脂肪氧化程度，延长货架期。试验组中鱼精蛋白处理组（C 组）与对照组（A 组）相比TBA 值变化无显著差异，这可能与大菱鲆脂肪含量较低有关。同样，刘剑侠[1]使用茶多酚处理大菱鲆鱼肉研究发现，在贮藏期内试验组鱼肉的TBA值相较于对照组无明显变化。其中香芹酚处理组（B 组）的TBA 值最低，这可能与香芹酚具有抗氧化活性有关[22]。

图4 不同处理组的大菱鲆鱼片在4 ℃冷藏条件下TVB-N 值的变化Fig.4 TVB-N value changes of different treated turbot fillets during storage at 4 ℃

图5 不同处理组的大菱鲆鱼片在4 ℃冷藏条件下TBA 值的变化Fig.5 TBA value changes of different treated turbot fillets during storage at 4 ℃

2.7 K 值分析

K 值是评价鱼体死后质量变化的新鲜度指标，反映水产品ATP 的降解程度，具体指次黄嘌呤核苷和次黄嘌呤占ATP 降解物的百分比[23]。通常认为，K 值低于10%为鲜杀鱼，K 值低于20%为生鲜品，K 值在20%～40%为一级鲜度，40%～60%为二级鲜度，高于60%即为腐败变质，K 值越低，表明生鲜品的新鲜度越高。由图6可知，随着贮藏时间的延长，K 值呈不断上升的趋势，贮藏初期（0～3 d），4 组鱼片的K 值相差不大，3 d 后，处理组的K 值均显著低于对照组，依次为A>B>C>D，由此可以看出鱼精蛋白的保鲜效果高于香芹酚，而复配后的效果则优于二者单独添加的效果。贮藏第6 天时，对照组K 值为63.67%（>60%），已发生腐败变质，而B，C 组处于二级鲜度，D 组的K值为38.12%，仍处于一级鲜度。且B，C，D 组分别在第9，12，15 天时，K 值超过60%，可见，香芹酚和鱼精蛋白复配能够显著减缓大菱鲆鱼片的腐败变质，有效延长货架期6～7 d，这与TVB-N 的结果相一致，因此，抑菌剂与群体感应抑制剂复合保鲜的方法可行。

2.8 pH 值分析

图7为不同处理组的大菱鲆鱼片在贮藏过程中pH 值的变化，4 组鱼片的pH 值呈先下降后上升的趋势。鱼体死后，体内糖原发生酵解，ATP 酶活力增强，乳酸量增加导致pH 值降低。鱼宰杀后数小时，机体进入自溶阶段，体内ATP 被完全降解，肌肉变软，多种蛋白水解酶开始发挥作用使蛋白质以及一些含氮物质被分解成氨、三甲胺等碱性物质，使得pH 值升高[24]。贮藏第3 天，3 个处理组鱼片的pH 值均低于对照组，且B，C，D 组之间相差不大。随着贮藏时间的延长，复配保鲜组（D组）的pH 值最低，这可能是由于香芹酚中含有酚羟基游离出H+，从而导致pH 值降低。此外，鱼精蛋白的抑菌作用以及香芹酚干扰QS 系统调控蛋白酶活性的协同作用也可以降低pH 值。

图6 不同处理组的大菱鲆鱼片在4 ℃冷藏条件下K 值的变化Fig.6 K value changes of different treated turbot fillets during storage at 4 ℃

图7 不同处理组的大菱鲆鱼片在4 ℃冷藏条件下pH 值的变化Fig.7 pH value changes of different treated turbot fillets during storage at 4 ℃

2.9 质构特性分析

鱼肉的腐败变质会使其咀嚼度、硬度、回复性和黏聚性等发生改变，本文测定大菱鲆鱼片在冷藏期间的相关质构指标，结果如表3所示。在贮藏

期内，大菱鲆鱼片质构参数改变与机体蛋白酶或者其它理化因素导致肌原纤维变化有关。大菱鲆鱼片的硬度在贮藏过程中呈先上升后下降的趋势，这是由于鱼体死后经过僵直、自溶2 个阶段导致。3 个处理组下降速率明显低于对照组，说明鱼精蛋白和香芹酚能够较好地维持鱼片的硬度。整个贮藏期内，弹性上下波动，与贮藏时间没有显著相关性，第15 天，对照组（A 组）的弹性最差，其咀嚼性和回复性均呈下降趋势。综上所述，处理组各指标均优于对照组，这可能是由于香芹酚干扰了酶活性，鱼精蛋白抑制了微生物的生长所共同导致。上述结果表明香芹酚和鱼精蛋白复配能够较好地维持大菱鲆鱼片的硬度，保持鱼片良好的质构特性。

表3 不同处理组的大菱鲆鱼片在4 ℃冷藏条件下质构特性的变化Table 3 Texture attributes changes of different treated turbot fillets during storage at 4 ℃

2.10 水分分布分析

低场核磁共振 （Low-field nuclear magnetic resonance，LF-NMR） 可以从微观角度探究组织中的水分分布及组成，是检测食品水分变化及迁移率的有效方式[25-26]。而弛豫时间可以通过质子弛豫状态来反映结合水与自由水之间的化学渗透交换程度，因此可以根据弛豫时间的不同将食品中的水分分为不易流动水、结合水和自由水。大菱鲆鱼片各组样品中结合水、不易流动水和自由水所占比例如表4所示。贮藏期间结合水变化与时间无显著相关性。自由水所占百分比随贮藏时间的延长呈显著上升趋势，不易流动水呈下降趋势，这是因为大菱鲆肌肉细胞发生无氧反应，造成通透性增强，致使肌丝空间膨胀，增强其吸水性，使胞内水分增加，胞外水分减少[27]。贮藏初期（0～3 d），4组鱼片自由水所占百分比相似，无明显差异；贮藏后期（9～15 d），处理组自由水百分比明显低于对照组，表明鱼精蛋白和香芹酚能够降低自由水含量，有效控制鱼肉的水分分布，增强鱼肉对水的束缚力，减少微生物的滋生。

表4 不同处理组的大菱鲆鱼片在4 ℃冷藏条件下水分分布的变化Table 4 Water distribution changes of different treated turbot fillets during storage at 4 ℃

3 结论

本研究探讨了由香芹酚和鱼精蛋白组成的复合生物保鲜剂对大菱鲆冷藏鱼片品质的影响，结果表明，处理组可有效延缓大菱鲆鱼片感官品质的劣变，其菌落总数、K 值、TBA 值及TVB-N 值均低于对照组；复配保鲜处理能够较好的维持大菱鲆鱼片的硬度，保持鱼片良好的质构特征，减少自由水的生成，增强鱼肉对水的束缚力，有效控制鱼肉的水分分布。综上所述，香芹酚可作为群体感应抑制剂应用于冷藏大菱鲆的贮藏保鲜，而常规抑菌剂与群体感应抑制剂复合应用于水产品保鲜中具有可行性。香芹酚处理组比对照组可延长大菱鲆鱼片货架期2～3 d，而香芹酚与鱼精蛋白复配可延长其货架期6～7 d。