缺口PCR与PCR－荧光探针在地中海贫血中的诊断价值分析

邓宇运 李雁

高州市中医院，广东 高州525200

地中海贫血是临床中常见的血液疾病之一，主要发病原因为血红蛋白中的珠蛋白缺失或不足［1］。该病分布各个国家，但存在明显的地域差异，东南亚发病人数较多［2］。目前，地中海贫血尚无有效治疗措施。临床上常采用婚前检查、胎儿产前基因诊断等预防措施降低地中海贫血的患病率，通过血液学、遗传学、分子生物学检查来诊断是否患有地中海贫血。Gap-PCR技术是临床常见的检测方法之一，通过PCR技术扩增基因，同时检测常见3种缺失型α-地中海贫血，为临床诊断提供有效试验依据。PCR-荧光探针法检测的是bai-SYBR Green掺入到双链duDNA中的量［3］，SYBR Green掺入到双链DNA中后会发出荧光，而探针法是当探针结合到目标序列上，聚合酶降解探针后，探针上自带的荧光基团离开淬灭基团，从而发出荧光，探针法特异性更强［4］。本研究探讨PCR检测在地中海贫血诊断中的应用价值，报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018年1月至2019年11月于我院婚前体检者298例，年龄25～38岁，平均年龄（27.59±4.28）岁；男：女=1∶1。分别采用缺口PCR与PCR-荧光探针两种方法进行检测，检测金标准为常规诊断和基因诊断两种方法联合诊断的结果。

1.2 纳入排除标准 纳入标准：①患者知情同意；②意识清楚，能正常表达。排除标准：①中途退出此次实验的患者；②既往存在血液疾病的患者。

1.3 仪器9600PCR扩增仪（珠海黑马公司）；DYY-8c型电泳仪（北京市六一仪器厂）；α-地中海贫血基因检测试剂盒（深圳亚能生物公司），荧光定量PCR仪（型号：SLAN-96P，上海宏石医疗科技有限公司）。

1.4 DNA提取和浓度测定 采用柱式法DNA提取试剂盒对外周静脉血样本提取DNA，并检测提取质量和浓度，DNA样本的OD260nm/OD280nm比值应在1.6～2.0之间，OD260nm/OD230nm比值需≥2.0，浓度需≥50ng/μL。

1.5 检测方法 所有患者均采用Gap-PCR与Gap-PCR技术检测α-地中海贫血基因。

1.5.1 Gap-PCR技术检测。α-地中海贫血基因检测试剂盒可同时检测中国人常见3种缺失型α-地中海贫血。严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.5.2 PCR-荧光探针法检测。每份样本的PCR反应体系为20μL，每次试验均做4个对比，每个受检样本复管测试，将反应管放在P荧光定量PCR仪上，选取需检测反应管位置，勾选FAM、HEX、ROX、CY54种荧光标记物，对反应管编号，扩增检测条件设置为37℃15min，95℃5min，1个循环；94℃30s→56℃10s→53℃60s，2个循环；92℃30s→60℃60s，30个循环。

1.6 结果判定 分别计算出各个样本、校准品的ΔCt值，再将待测样本的ΔCt减去校准品的ΔCt，得到ΔΔCt，计算2-ΔΔCt得出最终结果［4］。见表1。

1.7 MLPA复核不符样本 按多重连接依赖探针扩增（MLPA）说明书操作，对Gap-PCR技术和基因拷贝数直接定量技术检测结果不一致的样本进行重复验证。

表1 基因型结果判读标准

1.8 统计学分析 采用SPSS22.0软件进行统计分析，计数资料采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组检测结果比较Gap-PCR组共检出153例携带有α-地中海贫血基因缺失，其中，150例阳性，3例阴性，无α-地中海贫血基因缺失145例，PCR-FP组共检出150例携带有α-地中海贫血基因缺失，均为阳性，无α-地中海贫血基因缺失148例。见表2。

表2 Gap－PCR组和PCR－FP组检测结果比较（n）

2.2 不吻合样本复核结果MLPA复核结果为1例基因型是--/αα，另外1例基因型为α-/αα，与缺口PCR技术检测的结果相符，表明PCR-荧光探针法的检测存在一定误差，PCR-FP组漏检率为1.01%。

2.3 两组检诊断价值比较 两组诊断准确率、灵敏度、特异度无显著差异（P＞0.05）。见表3。

表3 Gap－PCR组和PCR－FP组检测的结果比较（%）

3 讨论

地中海贫血是一种较常见的遗传性疾病，有效预防本病的方法为抽血进行肽链检测和基因分析，通过检测父母是否患有该病，进而避免患病儿童的出生［5］。目前，针对地中海贫血的检测方法有多种，其中，有专门检测β-地中海贫血突变类型的方法，包括PCR-RDB、DNA测序等。检测α-地中海贫血突变类型的方法，包括MAPH、RTFQ-PCR、MLPA等［6］。缺口PCR技术是临床中检测α-地中海贫血的主要方法之一，该技术在α-地中海贫血患者的筛查及诊断中占重要地位［7］。MLPA技术在检测3种缺失型α-地中海贫血的应用效果较佳，可以同时检测多个靶序列拷贝数的改变，但该方法检测用时较长，试剂较昂贵，因此，临床应用规模较小［8］。报道显示，PCR-荧光探针法虽然检测有效率略低于Gap-PCR技术，有判断患者是否出现假阳性、使用仪器常规化、节约成本，同时操作简单，减轻医务人员工作量等明显优点［9］。

本研究显示，Gap-PCR共检出153例携带有α-地中海贫血缺失，无α-地中海贫血缺失145例，PCR-FP检测结果分别为150例、148例。MLPA复核结果与缺口PCR技术检测的结果相符，表明PCR-荧光探针法的检测存在一定误差，PCR-FP组漏检率为1.01%。PCR-FP组检测诊断的准确率组间无明显差异，两组诊断地中海贫血的灵敏度、特异性无显著差异。

综上所述，Gap-PCR与PCR-荧光探针法对α-地中海贫血均有一定诊断价值。