流感病毒检验及相关方法的研究进展

天津市海河医院（300350）秦中华

流感具有较高发病率及死亡率，在各个国家均有不同程度的发生率，导致急性呼吸道感染的主要病原之一，其属于正黏病毒科，是有包膜以及分阶段的单股负链RNA病毒[1]。目前流行病毒主要分为甲型及乙型，甲型流感病毒抗原变异较为活跃，对世界范围具有一定影响；乙型流感病毒感染及传播能力较甲型弱，但也会引起一定程度暴发流行。我国是流感病毒高发区，近年来，流感发生率不断升高，直接威胁人类生命健康[2][3]。因此，临床需寻求快速、准确且适用于临床应用的流感病毒诊断方式，以早期诊断、隔离及治疗。研究显示，流感病毒检验方式较多，但目前临床对其研究并不多见，为此，本文旨在对国内外流感病毒检验相关方法进行综述，为临床诊断提供思路。现综述如下。

1 病毒分离鉴定

病毒分离法是一种检测流感病毒的传统方式，虽然具有敏感性高且精确度高等优点，且可在一定程度上检测出病毒毒株情况，但是也具有一定局限，如检测周期较长，具有一定安全隐患，故不适宜大规模应用[4]。研究学者表明，在细菌培养后常常通过免疫荧光技术进行进一步鉴定，排除其他病毒可能性后，检测甲型流感病毒核蛋白，做出诊断。王林等[5]研究选取流感高峰季节收集流感哨点医院流感病例标本（ILI）1025份，采用犬肾传代细菌培养及实时荧光定量检测，对比两种方式检验差异情况；研究结果显示，在选取病例中，实时荧光定量检测流感病毒核酸阳性率为26.63%，细胞培养检出12.58%，差异有统计学意义（P＜0.05）；在273份阳性标本中，分离出118株病毒株，占43.22%，752例阴性标本中，分离出11株病毒株，占1.46%，实时荧光定量法检验阳性标本及阴性标本分离率差异显著。根据其研究可发现，实时荧光定量检测速度较快，灵敏性高，适用于临床检测及诊断流感疫情；细胞培养能够获得毒株，可进行基因特异性及耐药性等深入研究，二者结合诊断效果更佳。

2 免疫学检测

2.1 酶联免疫吸附实验 免疫学检测也是检测流感病毒常用方式之一，其主要依据抗原抗体反应进行检验，一般需要对血清中的抗原或者抗体进行检测。其中酶联免疫吸附法可用于检测抗原或抗体，具有方便快捷、灵敏度及特异度高等优点，是当前临床较为常用的免疫测定方式之一[6]。章倩云等[7]针对禽流感病毒M基因、H7基因以及N9基因的基因片段保守序列，进行特异性标记后，通过酶联免疫吸附法对PCR扩增情况进行判断；研究结果显示，其检测三个基因片段最低拷贝数敏感性高于普通PCR技术的10～100倍；此外，在不同流感病毒亚型间，不同病毒之间均不存在交叉反应现象；通过对临床114份标本进行检测发现，结果与鸡胚培养符合率达到100%。根据其研究结果可发现，酶联免疫吸附法操作简单，具有较高灵敏度及特异度，可广泛应用于流感病毒实验室检测。

2.2 免疫荧光技术 免疫荧光技术具有检测结果直观等优点，但是其仍具有一定局限，如对制备抗原具有较高要求，可能会产生非特异性染色体[8]。何洁静等[9]研究运用双抗夹心建立柯萨奇病毒A16型的时间分辨免疫荧光技术，对该种方法检测的灵敏度及特异度等进行分析；研究结果显示，时间分辨免疫荧光技术的检验，灵敏度为0.02ng/ml，回收率为100.2%～101.5%之间，将其与金标准PCR技术相比，检测结果的相关性较酶联免疫吸附法高。根据其研究结果可知，时间分辨免疫荧光法具有操作简单、灵敏度及准确度高等优点，适用于临床筛查柯萨奇病毒A16型。

2.3 胶体金免疫标记法 既往相关研究报道，通过胶体金可有效检测人绒毛膜的促性腺激素，这也成为临床免疫学研究的重点及热点，受到临床医学界及研究界广泛关注[10]。多年前，相关研究学者开始申请有关胶体金快速检测试纸相关专利，近年来，不少研究学者采用胶体金免疫法检测流感病毒，并取得一定研究结论。如郑嘉庚等[11]学者为建立一种快速定性检测血清丙型肝炎病毒（HCV）抗体方式，其根据双抗原夹心法实验原理，建立胶体金免疫层分析法对人体血清中丙型肝炎抗体进行检测；研究结果显示，阴性参考品及阳性参考品符合率达到100%，平行测定10条重复性参考品，全部显示阳性；通过检测血清1050份标本发现，其与酶联免疫吸附法符合率高达96.9%；又经检测发现，该方法检测灵敏度（97.90%）、特异度（99.00%）均较高。根据其研究可见，胶体金免疫标记法是一种更加方便、快速检测血清中HCV抗体方式，可为临床诊治提供重要参考价值。

3 流感病毒的核酸检测

3.1 聚合酶链反应 聚合酶链反应（PCR）是一项可在较短时间内大量扩增DNA片段的分子生物学技术，具有敏感性、特异性高等特点，可在较短时间内对流感病毒进行检测，对早期诊断流感病毒感染具有较高价值[12]。研究显示，PCR技术用于病原体的确定，可有效检测出早期感染患者，与病毒分离法比，其敏感性强500倍，但一般的PCR技术具有一定污染。蔡航航等[13]为了对比免疫组化法与PCR技术对EB病毒潜伏膜蛋白1（LMP-1）的检测价值，其选取50例鼻咽癌患者以及50例鼻咽炎患者进行分析对比，分别对不同患者标本采用免疫组化法及PCR技术进行检测；研究结果显示，与免疫组化法比，PCR技术检测LKP-1的灵敏度、准确度均较高，差异有统计学意义（P＜0.05），两种方式诊断特异度无差异。根据该研究结果可知，PCR用于检测LMP-1具有较高诊断准确度及灵敏度，用于临床具有更高价值。

3.2 环介导等温扩增试验（LAMP） LAMP是一种DNA环介导的等温核酸扩增方法，目前被临床广泛应用于检测多种病毒。目前的基因特异性扩增可通过光度法检测反应结束时溶液中所释放的相关副产物。研究显示，LAMP灵敏度与PCR相似，已被临床广泛应用于检测流感病毒。如赵娜等[14]应用LAMP技术检测乙型肝炎病毒，通过检测乙型肝炎病毒毒株以及临床样本，评价LAMP的灵敏度、特异度以及抗干扰性，并将研究结果与PCR进行对比；研究显示，LAMP技术特异性高，未产生非特异性扩增；煮沸法的LAMP与PCR技术具有较好一致性。根据该研究学者结果可发现，LAMP技术在检测乙型肝炎病毒中具有一定优点，通过该方式检测有利于提高临床检出率，为早期诊治提供重要参考价值。此外，基因芯片法也是核酸检测方式之一，可对数万个基因进行检测，该种方式通过在支持物上固定大量探针分子，将其与标记的样本分子进行杂交，进而通过所获得信号强度，对样本相关数量及序列相关信息进行分析。研究发现，该种方式具有较高灵敏度及特异度，但其对实验条件要求较高，价格昂贵，不方便一般检测。

4 小结与展望

流感是分布于全球的感染性疾病，不仅对人类生命健康造成严重威胁，也给国家经济发展及社会稳定造成一定威胁，故寻求安全可靠的流感病毒检测方式成为临床研究重点。病毒分离鉴定是检测流感病毒传统方式，其可有效检测出病毒毒株，具有精确度高等优点，但是其具有一定局限性，如操作较为复杂，等待时间长，很难被临床推广。核酸检测法是一种有效检测流感病毒方法，与传统方式比，其可在短时间内完成检测，但是其也具有一定局限性，如对检测技术人员要求较高，且价格昂贵，应用不多。免疫学检测操作简单，对检验人员要求不高，特别是胶体金免疫标记法所需时间更短，可现场检测，较为方便；其中酶联免疫吸附法具有检验迅速、灵敏度高且可定量等优点，被临床广泛应用。因此，临床需结合不同地区对流感病毒检测要求，选择适宜的检测方法及设备，提高诊断准确率。