角膜基质透镜修复角膜缺损的实验研究

李霞 林芳 雷代坤 高晓唯 刘毅 李鹏 蔡岩

随着飞秒激光近视手术的发展，飞秒激光微小切口角膜基质透镜取出术(small incision lenticule extraction,SMILE)中，透明角膜基质取材广泛，如能对其加以利用，将对临床有重要的指导意义。角膜损伤伴有角膜组织缺损，如直接缝合，常发生角膜变形，房水渗漏，形成浅前房、眼内感染等并发症。为了避免这些并发症的发生，临床上通常强行缝合角膜穿孔伤，但术后较严重的高度散光和不规则瘢痕愈合，极度影响II期、III期的术后效果。 本研究制作兔透明角膜基质透镜修复角膜缺损动物模型，观察其在角膜组织损伤修复中的机制及作用。

资料与方法

一、实验材料

1.健康清洁级新西兰白兔30只，雌雄兼用，质量2.00～2.50 kg，年龄2～3个月，购自新疆医科大学实验动物中心。

2.透明角膜基质的取材：人角膜基质透镜组织

图1 角膜缺损模型设计及制作方法 先行前房穿刺(黑色箭头)，用消毒滤纸片贴服于角膜中央(图A)，剖切角膜缺损模型(图 B) 图2 2 mm× 3 mm ×3 mm术后 图A、B 术后1 d，角膜植片混浊，皱褶，部分虹膜前粘连，前房残留少量气泡，前房形成欠佳，故再次行前房注气，形成前房；术后3个月，上方周边仍有少量虹膜前粘连，虽然前房形成，但新生血管侵入角膜(黑色箭头)，角膜白斑愈合(图C、D) 图3 2 mm×2 mm×2 mm 术后 图A 术后1 d，角膜植片混浊，角膜缝线固定，前房形成，前房内残留气泡，虹膜纹理清晰，瞳孔药物性散大，前房未见有炎症反应。术后1个月，角膜瘢翳形成，角膜缝线固定(图B)，随着时间推移，2个月时部分缝线松弛(图C)，术后3个月时角膜瘢痕愈合，已拆除松弛的角膜缝线(图D) 图4 2 mm× 2 mm ×2 mm术后3个月 图A、B 其他模型术后3个月，角膜单层圈套缝合，角膜瘢翳、云翳愈合，缝线上有分泌物粘附，角膜曲率基本正常来源于在我院近视眼治疗中心行 SMILE 的近视健康患者( 2019年6月)。

表1 透明角膜基质修复角膜缺损的长期效果

图5 眼前节OCT、Pentacam、角膜地形图检查(术后3个月) 前节OCT显示：A组角膜缺损处，角膜基质填塞，角膜凹凸不平，角膜内皮面有虹膜粘附(图A)，B组角膜缺损处，角膜基质填塞，角膜曲率平缓，但层间有间隙(图B)， Pentacam检查显示缺损处角膜高度突出，整体角膜曲率基本正常(图C)，角膜地形图显示，角膜散光仍较大(图D)

3.透明角膜基质保存(30只眼)：药用无水甘油保存[1]。使用时，取出透明角膜基质置于4 ℃的平衡盐中，去除黏附的甘油，备用。

二、实验方法

透明角膜基质修复角膜缺损模型制作：新西兰白兔30只(30只眼)，肌肉注射速眠新(1 ml/kg)，配合水合氯醛溶液(3 ml/kg)经耳缘静脉注射全身麻醉，并用盐酸丙美卡因滴眼液(5 ml/l)滴眼3次表面麻醉，术前聚氨碘氟酮消毒，手术均在显微镜下实施，用含庆大霉素的生理盐水冲洗结膜囊，上直肌固定缝线，A组用2 mm×3 mm×3 mm、B组用2 mm×2 mm×2 mm大小的消毒滤纸片贴服于右眼角膜中央(见图1)，选在透明角膜缘做前房穿刺，用尖刀剖切制作全层角膜缺损模型，取复水的透明角膜基质填塞于角膜缺损处，A组用单层、B组用双层圈套缝合联合斜形交叉、加固缝合，术毕散瞳，涂氧氟沙星眼膏。

三、术后处理

常规给予左氧氟沙星滴眼液点3/d、复方托比卡胺滴眼液点眼3/d、氧氟沙星眼膏点眼1/晚。造模后每日所有动物行裂隙灯观察眼前节变化，于造模后1 d、1周、1个月、3个月后各时间点行眼前节照相。3个月行Pentacam、角膜地形图检查后全部处死，光镜检查。

结 果

一、角膜缺损修复情况(见图2～5)

二、长期效果：见表(1)，术后3个月，A组：角膜瘢翳1只眼(6.7%)、角膜白斑14只眼(93.3%)、虹膜部分前粘连10只眼(66.7%)，新生血管侵入角膜11只眼(73.3%)，B组：角膜瘢翳6 只眼40.0%)、角膜白斑9只眼(60.0%)、新生血管侵入角膜1只眼(60.0%)，无虹膜前粘连。

所有透明角膜基质修复角膜缺损的动物均无排斥反应发生。B组术后随访3个月均保持正常的眼球外观，无浅前房、前房出血、排斥反应、角膜裂伤陊开、严重角膜扭曲变形发生。

三、组织病理学检查(见图6)

讨 论

对于角膜缺损修复，缝合技巧虽然至关重要，但修复材料决定了修复的效果。角膜组织缺损的临床最佳治疗方式可行穿透性角膜移植术，但新鲜角膜来源有限且手术难度较大，开展较为困难。筋膜、羊膜、巩膜组织、自体角膜、异体角膜等角膜替代物各有其优缺点[2-6]，因此在临床工作中，开发和利用角膜替代物具有重要意义。

图6 角膜组织切片HE染色 角膜基质层可见大量的中性粒细胞、单核细胞及淋巴细胞浸润，角膜上皮局部粘附略松弛，基质层可见新生血管管腔(x 100，A组，图A，黑色箭头)，有大量浆细胞及少量成纤维细胞(x 100, B组，图B)

近年来，有报道利用SMILE手术摘除的角膜基质透镜治疗角膜穿孔，基质透镜作为角膜基质的替代组织用于自体移植或异体供体移植已被报道[7-10]。有角膜基质透镜治疗远视、老花眼，联合用角膜交联治疗角膜基质扩张、圆锥角膜等的研究[11-15]。亦有基质小透镜作为补片移植物在治疗其他眼病中的应用[16，17]。角膜基质透镜有以下几个方面的优点，首先，角膜基质透镜具有良好的生物相容性和强度，薄而透明，其次该透镜很容易通过SMILE手术提取，并且成本低廉；但是基质透镜仍有几个缺点，在不做SMILE手术的医院很难获得，此外，单个角膜基质透镜的强度及力度仍较弱，直接缝合时容易撕裂，临床应用有其局限性且需进一步研究观察。目前除了上述临床报道外，在动物实验中尚未被探索。

SMILE来源的人角膜基质透镜移植可以有效的治疗感染或外伤导致的角膜穿孔。但是，角膜基质透镜究竟可以治疗多大的角膜缺损呢？因此我们制作兔透明角膜基质透镜修复角膜缺损动物模型，尝试探索其在角膜组织损伤修复中的适应症、机制及其作用。

我们的研究发现对于3 mm及以上的全层缺损，缝合困难，A组因虹膜部分前粘连模型较多，前房形成率欠佳，角膜漏导致虹膜前粘连(高达66.7%))，故角膜新生血管发生率较高(73.3%)，且角膜基质透镜厚度有限，虽然多层叠加、单层折叠后，或许可以达到有效的厚度，但手术操作难度大，缝合时透镜片滑动或撕裂，导致植片变形及边缘成角，造成角膜漏、散光或虹膜前粘连(图5A)、植片混浊、角膜新生血管侵入(图2D)。但对于2 mm的角膜全层缺损B组，术后观察期间内，术眼未出现感染，出血等并发症；未见植片脱落、植片融解、角膜钙化和免疫排斥等现象，出现1例(6.7%)植片和植床新生血管，所有模型以角膜瘢翳(40.0%) 、角膜白斑(60.0%)愈合(见图3D、图4A、图4B)。但前节OCT显示仍有层间间隙形成(图5B)，所以，对于单纯折叠来缝合临床上仍存在一些问题，应行角膜层间粘合后再进行角膜裂伤缝合较为稳妥[9，10]；B组3个月时虽然缝合处仍有凸起，但角膜曲率基本平滑(图5C)，角膜地形图显示缝合区域仍有散光(如图5D)，因此，单纯叠加的角膜基质透镜的生物力学强度还有待进一步加强。

我们实验局限性是，没有设计板层缺损，并且它不包括使用与羊膜联合应用情况，我们临床观察中发现，角膜基质透镜与羊膜一起使用时，成功率及术后视力恢复较单纯角膜基质透镜好。

我们的研究发现，对于大于2 mm×3 mm×3 mm的缺损，行缝合较为困难，最好行全穿透性角膜移植术或至少联合羊膜、筋膜移植；对于2 mm×2 mm×2 mm的角膜缺损，填塞的角膜基质透镜逐渐透明，与角膜组织融合紧密，角膜曲率相对平整，能够成功保住眼球，患者的视力尚能部分恢复，可应用于角膜组织缺损的替代物，并为二期手术治疗奠定基础。