特制接骨丸对Masquelet技术中诱导膜成骨因子表达的影响

张来福，郭绍勇，卢承印，王孝辉*

(1.河南中医药大学，河南 郑州 450046；2.河南省洛阳正骨医院，河南 洛阳 471002)

骨缺损在临床中较为常见，多由创伤、感染、肿瘤切除后造成，治疗中常因手术创伤大、治疗周期长、并发症多等给医患双方带来不少困扰[1]。MASQUELET等[2]最早报道利用膜诱导技术治疗35例骨缺损，其中骨缺损最长25cm，效果良好。Masquelet技术操作相对简便，适应证广泛，治疗周期也不受骨缺损长度的限制，因此在临床上得到了医患双方的青睐。对诱导膜的研究表明[3]，膜中包含血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)、转化生长因子β1(Transforming growth factorβ1，TGF-β1)、骨形态发生蛋白2(Bone morphogenetic protein-2，BMP-2)；其中VEGF和BMP-2可以促进骨髓干细胞的分化影响成骨过程，TGF-β1既可以影响VEGF的表达，也可以和VEGF共同影响血管的生成，诱导膜也具有一定的成骨特性。临床发现，骨缺损修复的效果与诱导膜的活性有关，如何提高诱导膜质量，增加生长因子的表达，提升诱导膜的活性，促进骨细胞的增殖分化，成为该技术需要解决的问题[4]。本院的内部制剂特制接骨丸能促进骨折愈合，在治疗骨折中后期延迟愈合或者不愈合方面具有良好效果。李阳阳等[5]报道，在胫骨横向骨搬移中服用特制接骨丸能促进成骨及钙化，加快骨缺损的修复。卢承印等[6]认为，特制接骨丸配合Masquelet技术能促进骨缺损的修复，可取得满意疗效。但特制接骨丸配合Masquelet技术的作用机制尚不清楚，其能否对形成的诱导膜中生长因子的表达产生影响尚不明确。因此本研究通过观察特制接骨丸对诱导膜中VEGF、BMP-2、TGF-β1等生长因子表达的影响，来探索特制接骨丸配合Masquelet技术的作用机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级3月龄雄性SD大鼠48只，体质量250～270 g，购自河南省动物实验中心[实验动物许可证号：SYXK(豫)2015-0001]。适应性喂养1周后开始实验。

1.2 实验用药与试剂

特制接骨丸[豫药制字Z04030038，河南省洛阳正骨医院(河南省骨科医院)]；抗生素骨水泥(美国强生有限公司)；青霉素钠(华北制药)；VEGF、TGF-β1、BMP-2抗体及抗体试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组及模型制作 按随机数字表法将48只大鼠分为空白组、低剂量组、中剂量组、高剂量组4组，各12只。术区备皮，术前30 min注射青霉素钠，采用3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，术区消毒、铺巾，在胫骨结节下纵向开长约1 cm的切口，暴露胫骨，电动摆锯截骨5 mm左右，克氏针髓内固定，骨缺损区用抗生素骨水泥填充，完全凝固后清洗缝合伤口。术后青霉素钠腹腔注射3 d。

1.3.2 灌药方法 将特制接骨丸与蒸馏水按不同比例混合，参照特制接骨丸(9 g/粒)的服用剂量，根据人与大鼠等效剂量的体表面积计算，得出大鼠的等效剂量为1.62 g/(kg·d)。低剂量组给予特制接骨丸1.62 g/(kg·d)，中剂量组给予4.86 g/(kg·d)，高剂量组给予14.5 8g/(kg·d)，空白对照组给予等量蒸馏水对照。术后第2天灌胃给药，1次/d，连续4周。

1.3.3 样本收集检测 于原切口切开，暴露抗生素骨水泥区，骨水泥表面可见一层红润透明状膜，切取膜组织，混合蛋白酶抑制剂和磷酸盐缓冲液，放入膜组织并用离心机以12 000 r/min的转速离心5 min，取上清液用酶联免疫吸附测定法测定，观察VEGF、BMP-2、TGF-β1的表达。

2 结果

2.1 模型制作

本研究所用抗生素骨水泥填塞大鼠骨缺损模型制作成功，饮食正常，大鼠伤口甲级愈合，健康存活至实验结束，期间未出现大鼠死亡病例。模型制作情况见图1。

图1 抗生素骨水泥填塞大鼠骨缺损模型

2.2 实验各组VEGF、BMP-2、TGF-β1的表达测定结果比较

给药4周后，对各组诱导膜中VEGF、BMP-2、TGF-β1的表达测定结果进行组间比较，差异有统计学意义，P<0.05。结果显示，实验组VEGF、BMP-2、TGF-β1的表达均高于空白组，且高剂量组表达最明显、中剂量组相对较弱、低剂量组次之，差异均有统计学意义，P<0.05。见表1-表3和图2-图4。

表1 各组诱导膜中VEGF指标比较

表2 各组诱导膜中BMP-2指标比较

表3 各组诱导膜中TGF-β1指标比较

注：红色箭头所指的蓝色部分为细胞核，黄色箭头所指的棕色部分为阳性表达

注：红色箭头所指的蓝色部分为细胞核，黄色箭头所指的棕色部分为阳性表达

注：红色箭头所指的蓝色部分为细胞核，黄色箭头所指的棕色部分为阳性表达

3 讨论

临床治疗骨缺损时，Masquelet技术具有适应证广泛、操作简单且治疗周期不受骨缺损长度限制等优势，为医患双方所接受[7]。Masquelet技术分两步，第一阶段：骨缺损区清创彻底，植入抗生素骨水泥混合物，诱导形成纤维膜；第二阶段：数周后，骨水泥周围形成类骨膜的纤维膜，切开纤维膜，完全去除骨水泥，在膜内植入适量自体骨，固定数周，促进新骨生成，修复骨缺损。诱导膜具有类骨膜的生物学特性和独特的结构特征，含有丰富的血管网，并且包含VEGF、BMP-2、TGF-β1等多种生长因子。研究证实[8]诱导膜中成骨因子的表达在4～6周达到峰值，为了避免药物加速诱导膜中成骨因子达到峰值而影响结果，本研究选择在骨水泥植入后的第4周对各组诱导膜中成骨因子表达含量进行测定。

在本研究中，高剂量组中的VEGF、TGF-β1、BMP-2因子表达最多，中剂量组、低剂量组、空白组的表达依次减少，且各组之间的差异均有统计学意义。现代研究证实[9]，VEGF是血管生成中的重要生成因子，可与血管内皮细胞的特异性受体结合，积极调控血管的生成过程。由于骨的高度血管化，VEGF在骨修复和再生中也起着重要作用，研究表明成骨细胞中VEGF水平可以为骨修复和再生提供基础[10-12]。VEGF在整个成骨过程中有持续表达[13]，用能缓慢释放VEGF的材料可以更好地促进骨修复[14]。TGF-β1是存储在骨组织中最丰富的生长因子之一，能有效调节成骨细胞的增殖分化及细胞外基质的产生，通过刺激干细胞的增殖分化，加速成骨细胞的增殖，进而诱导膜内成骨以及软骨内成骨[15]。BMP-2是转化生长因子超家族的成员，是参加软骨再生的主要软骨生长因子，诱导各种类型干细胞中的软骨形成分化及成骨的骨化[16]，既可以通过调控骨细胞中的VEGF表达，生成血管，也可以激活Smad蛋白的信号通路，促进骨髓基质细胞分化成骨细胞[17-18]。研究显示[19]，BMP-2可增加VEGF的表达，并结合作用于成骨细胞和血管内皮细胞中，加速血管化和成骨化。诱导膜中的成骨细胞和生长因子的表达水平能影响骨细胞的增殖和骨折愈合时间，是促进移植骨形成新骨、修复骨缺损的关键因素之一[20]。

《素问·阴阳应象大论篇》曰：“肾生骨髓，在体为骨。”因此可从补肾强骨论治骨折或骨折不愈合。特制接骨丸，是全国名老中医毛天东主任医师总结出的专用于骨折中后期延迟愈合或不愈合的方剂，具有益肝肾、理气血、强筋骨、壮元阳、填精髓的功效。方药由黄芪、骨碎补、红参、鹿茸、白术、山药、杜仲、地龙、枸杞、茯苓、续断、自然铜、三七、土鳖虫14味中药组成。骨折后期气血、肝肾亏虚，治疗当以补为要，方中黄芪、骨碎补为君，补气养血、补肾强骨；红参、自然铜为臣，益气摄血、续筋接骨；佐余下诸药以养气血、补肝肾、续筋接骨。杜贵强等[21]通过对98例骨折患者进行对比治疗研究，证实特制接骨丸能有效促进骨折愈合，缩短愈合周期。而特制接骨丸对于诱导膜的作用未见报道，为此我们选择特制接骨丸进行干预Masquelet技术中诱导膜的形成实验，以揭示特制接骨丸对诱导膜中成骨因子表达的影响。

本研究结果表明，特制接骨丸能促进诱导膜中VEGF、TGF-β1、BMP-2成骨因子的表达，且表达水平与特制接骨丸的剂量成正相关。但是，本研究仅从诱导膜生长因子表达的情况进行分析，其在二期植骨术后对骨愈合的影响效果尚需要进一步证实。