PCPA对大鼠大脑皮质P450scc、CB1R、MAP2基因表达的影响及酸枣仁汤的干预作用研究

石 鹏，滕 柳，郭海波，王 慧

(贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025)

神经甾体是一类存在于中枢或外周神经系统中，与神经系统功能密切相关的一类甾体化合物。神经甾体很早就被认为具有镇静、麻醉和抗癫痫的作用。神经甾体是神经兴奋性的内源性调节因子，中枢神经系统(Central nervous system，CNS)中合成的神经甾体会通过非基因组机制影响CNS的兴奋性[1]。中枢神经系统中合成神经甾体需要以胆固醇为原料，P450胆固醇侧链裂解酶(P450 cholesterol side chain cleavage，P450scc)位于线粒体内膜，能将胆固醇催化形成孕烯醇酮(Pregnenolone，PREG)，是神经甾体合成中的限速步骤，神经甾体与细胞表面受体结合后，能快速改变神经兴奋性[2]。有关研究[3]表明，大麻素受体1(Cannabinoid receptor1，CB1R)、微管相关蛋白2(Microtubule-associated protein 2，MAP2)也是神经甾体的作用靶点。CB1R在大脑中广泛表达，PREG是CB1受体的负向别构分子，神经甾体通过CB1R与焦虑、抑郁相关。PREG通过充当激动剂与MAP2特异性结合，在脑发育、突触可塑性、抑郁中具有一定作用[4]。目前，学界认为中枢五羟色胺(5-hydroxy tryptamine，5-HT)与皮层兴奋性密切相关。5-HT与神经甾体均能参与中枢兴奋性的调节，但二者在中枢兴奋性调节中的相互作用尚不清楚。对氯苯丙氨酸(Para-chlorophenyl alanine，PCPA)是色氨酸羟化酶的不可逆抑制剂，可以有效阻断脑内5-HT的合成，降低脑内5-HT含量，广泛应用于睡眠-觉醒研究中[5]。酸枣仁汤(Suanzaoren decoction，SZRD)是治疗失眠的经典方剂，研究显示酸枣仁汤对参与睡眠-觉醒调节的单胺类神经递质和氨基酸类神经递质具有调控作用[6]。因此，本实验通过大鼠腹腔注射PCPA，观察大鼠脑内5-HT下降后，皮质P450scc、CB1R、MAP2 mRNA表达情况及酸枣仁汤的干预作用，探讨5-HT与神经甾体的相互作用关系，揭示酸枣仁汤治疗失眠的潜在机制。

1 材料与试剂

1.1 动物

健康SPF级雄性SD大鼠50只，体质量(200±20)g，购买于长沙市天勤生物技术有限公司，许可证号：NO.SCXK(湘)2014-0011。在恒温(22±2)℃、安静的环境中适应性喂养1周，实验期间自由摄食饮水。实验条件符合贵州中医药大学动物伦理和实验相关要求。

1.2 药物仪器及试剂

PCPA(C-6506，Sigama公司)；酸枣仁汤(酸枣仁、川芎、茯苓、知母、炙甘草)于北京同仁堂贵阳店购买；旋转蒸发器(RE-5203，上海亚荣生化仪器厂)；7500实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)；超微量分光光度计(德国Implen公司)；Trizol(Invitrogen公司)，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit逆转录试剂盒；PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix(赛默飞世尔科技有限公司)，RT-PCR引物由上海生工生物技术服务有限公司合成。

2 实验方法

2.1 药物准备

酸枣仁汤依据第五版《方剂学》教材：称取酸枣仁18 g，知母10 g，茯苓10 g，川芎5 g，炙甘草3 g，10剂共460 g。加8倍水浸泡1 h，煎煮1 h，纱布滤过，药渣加入6倍水煎煮30 min过滤药液，合并两次药液旋蒸浓缩至含生药量1.5 g/mL的浓缩药液[7]，4 ℃冰箱保存备用，临用时按需取用水浴复温。

PCPA悬浮液配制：PCPA按350 mg/kg计算称取用量[1]，置于研钵内间断少量加入生理盐水持续研磨30 min，配制成PCPA悬浮液，4 ℃保存备用，使用前充分混匀。

2.2 动物分组及给药

大鼠随机分为正常组、对照组、PCPA组、SZRD组、PCPA+SZRD组，每组10只。正常组不做任何处理，PCPA组和PCPA+SZRD组按350 mg/kg腹腔注射PCPA，对照及SZRD组腹腔注射等体积生理盐水，每天1次持续6天。第7天起SZRD组和PCPA+SZRD组以7.5 g/kg剂量，10 mL/kg体积灌胃SZRD，对照组和PCPA组灌胃等体积生理盐水，每天1次持续8天。

2.3 取材

末次给药2 h后，以10%水合氯醛 (300 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，冰上迅速取出脑组织，去除脑干、嗅球，分离皮质置于标记好的预冷EP管中，液氮速冻，转入-80 ℃保存备用。

2.4 引物设计

引物使用Primer5.0设计，上海生工生物技术服务有限公司合成，见表1。

表1 引物序列及大小

2.5 RNA提取，逆转录及RT-PCR反应条件

Trizol法提取总RNA，超微量分光光度计测定RNA浓度和纯度，样本纯度均符合1.8～2.0标准，随即按照逆转录试剂盒要求进行逆转录得到cDNA，-20 ℃保存备用。RT-PCR参照说明书采用20 μL体系，反应条件为：UDG酶激活50 ℃ 2 min，预变性95 ℃ 2 min，变性95 ℃ 15 s，退火/延伸60 ℃ 1 min，40个循环。

2.6 统计学处理

3 结果

3.1 动物一般情况

PCPA腹腔注射3天后与对照组相比可见大鼠饮食减少，白天活动增加，攻击性增强，皮毛无光泽，出现一系列脑内5-HT浓度下降表现[1]。

3.2 PCPA对大鼠大脑皮质P450scc、CB1R、MAP2 mRNA的影响

与对照组比较，PCPA组P450scc mRNA表达增加(P<0.05)，CB1R mRNA表达下降(P<0.01)，MAP2 mRNA表达降低(P<0.05)，差异具有统计学意义，见表2。

3.3 酸枣仁汤的干预作用

与PCPA组比较，PCPA+SZRD组P450scc mRNA表达降低(P<0.05)，CB1R mRNA表达增加(P<0.05)，MAP2 mRNA表达增加(P<0.01)，差异具有统计学意义。与对照组比较，SZRD组P450scc、CB1R、MAP2 mRNA表达无统计学差异(P>0.05)，见表2。

4 讨论

神经甾体及其代谢产物在皮层兴奋性、学习记忆、神经保护等方面具有广泛作用[8]。5-HT也与皮层兴奋性关系密切，目前尚不明确5-HT和神经甾体间的功能关系。PCPA是研究中枢5-HT与其他神经递质功能关系的经典药物[9]。本实验结果显示(表2)，PCPA能导致大鼠大脑皮质P450scc表达增加，CB1R、MAP2表达下降，酸枣仁汤能降低P450scc表达，上调CB1R、MAP2受体表达。对照组与正常组比较，P450scc、CB1R、MAP2表达无统计学差异，表明灌胃、腹腔注射等侵袭性操作对上述指标无明显影响。

表2 各组大鼠皮质P450scc、MAP2、CB1受体mRNA表达情况

神经甾体的合成和代谢过程需要多种酶的参与，P450scc是神经甾体生成中关键的酶之一[10]。星形胶质细胞、少突胶质细胞均可表达P450scc[11]，其中P450scc mRNA主要表达于星形胶质细胞中。中枢神经系统中星形胶质细胞数量众多且分布广泛，能调节神经元的兴奋性和突触活动，与睡眠-觉醒关系密切，在维持中枢神经系统稳态和功能方面具有重要作用，本课题组前期研究发现，PCPA腹腔注射能激活星形胶质细胞，上调星形胶质细胞特异性标志物胶质原纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein，GFAP)表达[12]。还有研究[13]显示，在癫痫的病理过程中，星形胶质细胞转化为反应性细胞并表达高水平的P450scc，从而成为神经甾体合成的主要参与者。因此，笔者推测本实验腹腔注射PCPA后上调的P450scc可能主要来源于激活后的反应性星形胶质细胞。另有研究[14]发现，孕期胎儿脑中具有较高浓度的神经甾体物质，使得胎儿在孕期大部分时间都处于类似睡眠的行为状态。本实验中大鼠脑内5-HT含量下降后，P450scc表达增加可能意味着大鼠脑内神经甾体含量的波动，这可能是导致睡眠-觉醒异常的原因，酸枣仁汤的干预作用可能是恢复脑内神经甾体水平，其具体机制还有待深入研究。

目前学界认为，神经甾体主要通过GABAA受体参与中枢神经系统兴奋性的调节，神经甾体作用于GABAA受体后能使其介导的Cl-通道开放，氯离子内流增加产生抑制性电流，参与中枢兴奋性的调节，使神经甾体在狂躁、焦虑、抑郁等中枢神经系统疾病的治疗方面具有一定的临床潜力[15]。CB1受体存在于GABA能和谷氨酸能神经元富集的区域且参与了信息传递过程，因此可以认为内源性大麻素系统能够参与调控兴奋或抑制性神经传递，具有双向调控作用[16]。有关研究[17]显示，通过CB1受体介导的内源性大麻素信号传导对于非快速眼动睡眠的稳定是必要的。5-HT2C受体和CB1受体之间存在相互作用从而调控大鼠睡眠-觉醒模式[18]。本实验结果显示，PCPA导致CB1R表达下降，这也表明5-HT与CB1R在睡眠-觉醒调节中可能也存在相互作用，酸枣仁汤可能通过增加CB1R的表达影响皮层兴奋性，其中的具体机制还有待进一步研究。

MAP2是调节微管蛋白组成的重要调节因子，在稳定微管、神经元发育、突触可塑性等方面具有重要作用[19]。有学者[20]将MAP2作为神经元正常结构的标志物，相关研究显示，快速眼动睡眠剥夺后大鼠皮层MAP2表达减少且能观测到髓鞘溶解等细胞超微结构异常，本实验的结果也发现，PCPA组与对照组比较，MAP2表达下降。笔者研究团队前期实验发现，PCPA能导致大鼠脑内微透析液中谷氨酸的含量增加[21]，能上调大鼠大脑皮质中代谢型谷氨酸受体mGluR1、mGluR2的表达[22]，还能增加N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受体的表达[23]。因此，可推测PCPA导致MAP2表达降低的机制可能是：过度激活的NMDA和代谢型谷氨酸受体，通过Ca2+通道导致Ca2+内流增加，胞内Ca2+超载等途径引起的细胞毒性从而导致MAP2降解。

睡眠障碍可能增加多种心血管疾病及代谢性疾病的患病风险，是一个严重的公共卫生问题[24]。睡眠的调节与皮层兴奋性调节密切相关，探究5-HT与神经甾体的功能关系，有利于进一步明确皮层兴奋性的调节机制，进而为失眠的治疗提供新的治疗靶点，酸枣仁汤可能通过调节P450scc、CB1R、MAP2的表达对失眠发挥治疗作用，这可能是酸枣仁汤治疗失眠的潜在机制之一。