lncRNA NCK1-AS1在肝细胞肝癌组织中的表达及临床意义*

杨鹏生，宋黎明，段希斌，梁马可，梁占强，李学民

(郑州市中心医院肝胆胰腺外科，河南 郑州 450000)

肝细胞肝癌(以下简称肝癌)是全世界最常见的恶性肿瘤之一。研究表明，我国是全球肝癌发病数和病死数最多的国家，约占全球一半以上[1-3]。目前，治疗肝癌的主要方法是手术切除，但术后患者5年生存率仅约为50%，其复发率高达70%。导致肝癌患者预后不良的原因通常是缺乏有效的早期诊断[4-6]。因此，临床亟须寻找一种与肝癌发生、发展密切相关，且能预测患者复发、转移及预后的新型指标，从而为肝癌的早期诊断和治疗提供新策略。

越来越多的证据表明，长链非编码RNA(lncRNA)的表达具有组织特异性，在多种肿瘤中经常表达失调，一些lncRNA与肿瘤复发和预后不佳相关[7-8]。lncRNA被定义为长度超过200个核苷酸的非蛋白编码转录本，一般来说，约78%的lncRNA具有组织特异性。除了更高的组织特异性外，lncRNA还具有更高的发育阶段特异性，以及在异质组织(如人类新皮层)中的细胞亚型特异性[9-10]。现有研究指出，lncRNA可作为癌症患者淋巴结转移的分子标志物，与癌症的进展密切相关[11]。lncRNA NCK1-AS1是lncRNA家族成员之一，在宫颈癌、前列腺癌的相关研究中显示，其表达与患者不良预后相关[12-13]。本研究通过分析lncRNA NCK1-AS1在肝癌组织中的表达特点，探讨其与临床病理指标、预后的关系，以期为肝癌的诊断提供新靶点。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2015年4月至2017年6月本院肝癌确诊患者73例，其中男48例，女25例；年龄42～78岁，平均54.4岁。所有患者均按照世界卫生组织中关于肝癌的诊断标准进行确诊，且在术前未接受过放化疗。采集肝癌组织及配对的癌旁组织(癌旁组织取于距肿瘤病灶2 mm以上的肝癌组织)，放入冻存管进行标记，液氮贮存。根据肝癌组织中lncRNA NCK1-AS1表达水平将研究对象分为高表达组(33例)和低表达组(40例)。本研究经医院伦理委员会批准，所有患者均知情且签署知情同意书。术后对所有患者进行上门或电话随访，随访时间为手术当天至死亡当天或随访截止日。

1.2方法 (1)采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测lncRNA NCK1-AS1表达水平。利用Trizol法提取组织样品或培养细胞的总RNA，利用RNA反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA。以cDNA为模板，利用Primer5.0设计引物，lncRNA NCK1-AS1正向引物为5′-TTC CCA TTT CTC CCA GGT CC-3′，反向引物为5′-TGG TTA CTT TGA GCC TGC CT-3′；β-actin正向引物为5′-AGC CTC GCC TTT GCC GA-3′，反向引物为5′-CTG GTG CCT GGG GCG-3′；miR-361-5p正向引物为GGG AGG TTA TCA GAA TCT CCA GG，反向引物为CAG TGC GTG TCG TGG AGT；U6正向引物为5′-ATT GGA ACG ATA CAG AGA AGA TT-3′，反向引物：5′-GGA ACG CTT CAC GAT TTG-3′。根据PCR试剂盒添加各组试剂配制荧光定量PCR反应体系，反应程序采用两步法，每组设置3个重复，以β-action/U6为参照基因，采用2-ΔΔCt法计算lncRNA NCK1-AS1的相对表达水平。(2)lncRNA NCK1-AS1靶向基因预测。通过Starbase数据库检索发现lncRNA NCK1-AS1的靶向miR-361-5p，分析lncRNA NCK1-AS1与miR-361-5p表达的相关性。RNA提取试剂盒、Trizol试剂、荧光定量试剂盒均购自上海百研生物科技有限公司；引物序列由北京六合华大基因科技有限公司合成；NanoDrop微量核酸测定仪购自上海创萌生物科技有限公司。

2 结 果

2.1肝癌组织和癌旁组织中lncRNA NCK1-AS1表达水平比较 肝癌组织组中lncRNA NCK1-AS1相对表达量高于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 肝癌组织和癌旁组织中lncRNA NCK1-AS1表达情况

2.2不同lncRNA NCK1-AS1表达水平组临床病理参数比较 低表达组分化程度、淋巴转移及TNM分期情况与高表达组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 不同lncRNA NCK1-AS1表达水平组临床病理参数比较(n)

续表1 不同lncRNA NCK1-AS1表达水平组临床病理参数比较(n)

2.3不同lncRNA NCK1-AS1表达水平组生存期比较 低表达组中位生存期为20个月，明显高于高表达组的15个月，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4lncRNA NCK1-AS1与miR-361-5p表达的相关性分析 通过Starbase数据库检索发现，lncRNA NCK1-AS1与miR-361-5p存在靶向调控位点，见图2A。肝癌组织中miR-361-5p相对表达量低于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2B。lncRNA NCK1-AS1与miR-361-5p表达呈负相关(r2=0.078 6，P<0.001)，见图2C。利用Starbase数据库进行lncRNA NCK1-AS1与miR-361-5p共表达分析，两者呈负相关(P<0.05)，见图2D。

A为lncRNA NCK1-AS1与miR-361-5p的靶向序列信息；B为miR-361-5p在肝癌组织和癌旁组织中的表达；C为lncRNA NCK1-AS1与miR-361-5p表达的相关性；D为lncRNA NCK1-AS1与miR-361-5p共表达分析。

3 讨 论

肝癌恶性程度高、隐匿性强、进展速度快，很多患者就诊时已处于中晚期，失去手术机会。另外，肝癌术后易复发转移，导致5年生存率低。肝癌的发生、发展涉及多步骤、多阶段渐进演化，囊括多种基因的异常表达和表观遗传学的变化[14]。既往研究显示lncRNA可参与肿瘤发生、发展过程，可能通过DNA、RNA、蛋白质3个方面参与复杂的分子调控机制。由于lncRNA的表达量或状态均可作为效应分子，其表达水平高低反映肿瘤性质，故其与mRNA相比，是更好的肿瘤诊断层面标志物[15]。lncRNA作为一种新型肿瘤标志物，在肝癌组织发生、发展的调控过程中具有不可小觑的作用，对深入探究肝癌的发病机制并制定有效的早期诊断及治疗策略具有重要意义。

国内外研究表明，lncRNA NCK1-AS1在膀胱癌、卵巢癌、宫颈癌、鼻咽癌中发挥重要作用。lncRNA NCK1-AS1在宫颈癌中过表达，并通过与miR-134的相互作用促进癌细胞的迁移侵袭和细胞增殖[16]。有研究发现，lncRNA NCK1-AS1促进NCK1表达会抑制化疗过程中化学耐药性的发展，促进卵巢癌的发生[17]。有研究显示，前列腺癌中lncRNA NCK1-AS1表达会上调，而沉默lncRNA NCK1-AS1抑制了这种作用，会抑制膀胱癌细胞增殖和肿瘤细胞干性[18]。沉默lncRNA NCK1-AS1表达通过上调miR-135a抑制鼻咽癌癌细胞的迁移和侵袭[19]。lncRNA NCK1-AS1表达在肝癌中的作用研究鲜有报道。本研究利用qRT-PCR检测肝癌患者肝癌组织和癌旁组织中lncRNA NCK1-AS1表达发现，肝癌组织中lncRNA NCK1-AS1表达水平明显高于癌旁组织，lncRNA NCK1-AS1表达与分化程度、淋巴转移和TNM分期等生物学行为相关，且lncRNA NCK1-AS1高表达患者预后较lncRNA NCK1-AS1低表达患者差。提示lncRNA NCK1-AS1可能成为肝癌预后的分子标记物。通过Starbase数据库检索发现，miR-361-5p可能为lncRNA NCK1-AS1潜在的靶向调控位点。肝癌患者miR-361-5p表达下调，其可通过靶向血管内皮生长因子A抑制肝癌细胞增殖和侵袭。miR-361-5p可通过抑制CXC趋化因子受体6表达而抑制肝癌细胞增殖，过表达miR-361-5p可显著抑制裸鼠体内肿瘤生长。本研究结果显示，肝癌组织miR-361-5p表达下调，lncRNA NCK1-AS1与miR-361-5p表达呈负相关。因此，lncRNA NCK1-AS1可能通过调控miR-361-5p表达来发挥作用。

综上所述，肝癌组织中lncRNA NCK1-AS1呈高表达，与患者不良预后相关，其可能通过调控miR-361-5p表达来发挥作用。lncRNA NCK1-AS1可能会成为研究肝癌致病的分子机制之一，并可能成为肝癌诊断和预后判断的新靶点。