羊水穿刺与无创DNA产前检测的对照研究

于 艳，杨 彦

(江苏大学附属镇江市第四人民医院产前诊断中心，江苏 镇江 212000)

我国每年新增出生缺陷儿有80万以上，约占年出生人口4%～6%。随着国家二胎政策的开放，高危孕妇数量相应升高，出生缺陷防治工作形势日益严峻。通过介入性产前诊断和细胞遗传学、细胞分子遗传学等方法对高危孕妇进行产前诊断可及时发现胎儿染色体异常，减少出生缺陷，并可为再次妊娠提出医学建议。羊水穿刺进行细胞染色体核型分析是诊断染色体疾病的主要方法，但存在宫内感染、流产等风险。随着无创DNA产前检测(NIPT)的广泛应用，越来越多高危孕妇选择NIPT筛查染色体病。本研究通过对具备产前诊断指征的孕妇行羊水穿刺和NIPT，探讨二者在胎儿染色体疾病检出方面的差异性。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2016年1月1日至2019年6月30日本院就诊的具备产前诊断指征的单胎妊娠孕妇2 991例，分为羊水穿刺组(809例)和NIPT组(2 182例)。纳入标准：年龄大于或等于35岁；孕中期血清学筛查高风险；B超结构异常(包括B超软指标异常和结构异常)及其他(包括不良孕产史、孕期用药、宫腔感染等)。孕妇及家属知情同意并签署知情同意书。2组一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2方法 (1)羊水细胞取样及处理：孕妇于妊娠18～22+6周行羊水穿刺。在严格无菌条件下，超声引导经腹部行羊膜腔穿刺，抽取羊水20 mL。在实验室对羊水细胞进行处理，经过培养、观察、消化、低渗、固定、滴片、烤片、胰酶分带、G染色等步骤，最后行染色体核型分析计数。(2)NIPT法：孕妇于妊娠12～22+6周行NIPT。无菌条件下采集孕妇外周血10 Ml,置于乙二胺四乙酸抗凝管中。离心并提取血浆中胎儿游离DNA，聚合酶链反应扩增建立文库，依托Ion Proton平台，采用BioelectronSeq 4000高通量测序仪器，应用半导体测序法进行高通量基因测序及数据分析，计算胎儿21-三体综合征、18-三体综合征、13-三体综合征发生情况。如检测结果为低风险，待胎儿出生后电话随访，明确是否存在假阴性结果；如检测结果提示高风险，与孕妇及家属充分沟通，在其知情同意下行羊水穿刺进行诊断。

1.3统计学处理 采用STATA10.0统计软件进行统计学分析。计数资料以率或百分比表示，组间比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1羊水细胞染色体核型分析结果 809例孕妇中，染色体核型异常27例,染色体核型异常情况及检出率见表1。羊水穿刺组中，不同产前诊断指征孕妇胎儿染色体核型异常情况见表2。

表1 羊水细胞染色体核型分析结果(n=809)

表2 羊水细胞异常染色体核型分析结果(n=27，n)

2.2NIPT检测结果 2 182例孕妇中，NIPT高风险32例。后经羊水穿刺确诊染色体核型异常18例，染色体核型异常情况及检出率见表3。对于NIPT低风险者于预产期3个月后进行电话随访，采集妊娠期产前检查情况及结局、新生儿检查情况等信息，共完成随访1 854例，未发现NIPT假阴性，其中21例存在不良妊娠结局，包括超声检查异常13例(终止妊娠7例，存活5例)，流产4例，死胎2例，新生儿死亡2例。NIPT组中，不同产前诊断指征孕妇胎儿染色体核型异常情况见表4。

表3 NIPT检测结果(n=2 182)

表4 NIPT高风险者羊水染色体核型分析结果(n=18，n)

2.32组染色体异常检出情况比较 2组染色体异常检出情况比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表5。

表5 2组染色体异常检出情况比较(n)

3 讨 论

中国出生缺陷防治报告(2012)显示,我国出生缺陷发生率约为5.6%。从出生缺陷分类来看，主要包括结构异常、染色体病、基因病及代谢异常等4类[1]。可见染色体病是导致出生缺陷的常见原因之一，约0.5%新生儿患有染色体病[2]。临床上较常见的染色体病有21-三体综合征、18-三体综合征、13-三体综合征、Turner综合征等。染色体病造成的出生缺陷往往比较严重，主要表现为严重的智力异常、结构畸形、发育迟缓等，孕期可致流产或死胎。目前对染色体病缺乏有效的治疗手段。因此，孕期及时发现胎儿染色体异常并终止妊娠是降低出生缺陷发生率的有效方法，且可以为再次妊娠提供遗传咨询。

介入性产前诊断技术的临床应用为孕期胎儿染色体病的检出提供了重要支持。该类技术通过取样获得胎儿细胞进行染色体核型分析，从而诊断染色体病。目前临床常用的方法主要包括孕早期绒毛穿刺、孕中期羊膜腔穿刺及孕中晚期脐静脉穿刺，其中羊膜腔穿刺(羊水穿刺)技术应用最为广泛。常见的适应证如孕中期血清学筛查高风险孕妇、高龄孕妇、B超结构异常及软指标异常、不良孕产史、环境致畸因素接触史等。3种方法在成功率、安全性及有效性等方面均较高[3]。但随着介入性产前诊断技术的不断应用，其带来的局限性也备受关注。相关文献报道，介入性产前诊断的风险主要表现在感染、1%～2%的流产风险及感染可能诱发的早产等[4-5]。有研究证明，孕妇在操作过程中越焦虑，自我感知的疼痛强度就越高[6]。另外，操作前需排除先兆流产等相关禁忌证。

近年来，NIPT技术因无创、安全、检测时间早且报告周期短等优势被广泛应用。该方法是通过对孕妇外周血中的游离DNA进行高通量测序，来评估胎儿常见染色体非整倍体包括21-三体、18-三体和13-三体的风险。临床研究证明，NIPT对其具有很高的敏感度、特异度及阳性预测值。对于除这3种目标疾病以外的染色体非整倍体和染色体结构异常的筛查是否推荐NIPT，目前尚无循证证据支持[7]。PETERSEN等[8]对19万余孕妇资料进行分析，涉及染色体核型异常的胎儿1 122例，其中262例伴有临床表型，但不属于21-三体综合征、18-三体综合征和13-三体综合征，如选择NIPT进行检测将导致漏诊。因此，NIPT能否有效减少介入性产前诊断带来的风险，有待商榷。

随着孕妇年龄的增长，胎儿染色体异常风险相应增高。随着国家“二孩政策”的开放，高龄孕妇数量逐年增加，出生缺陷防治工作形势严峻。我国现行的政策是将高龄作为介入性产前诊断的明确指征[9]。本研究结果显示，对于年龄大于或等于35岁的孕妇，羊水穿刺组染色体异常检出率为3.42%，NIPT组为0.68%，与殷一旋等[10]研究结果一致。NIPT在安全无创方面优势明显，并可降低孕妇对羊水穿刺带来的胎儿流产、宫内感染等风险所产生的心理压力，但从胎儿染色体异常的检出结果分析，依旧无法取代羊水穿刺。血清学产前筛查是通过检测孕妇甲胎蛋白、游离绒毛膜促性腺激素等特殊标志物，结合其相关信息，换算出胎儿患21-三体综合征，18-三体综合征及开放性神经管畸形的风险。研究认为，血清学产前筛查不仅可用于上述3种情况，同时还可筛查其他染色体异常，而且高风险孕妇胎儿即使染色体正常，其不良妊娠结局风险也会增高[11]。目前，血清学筛查高风险时，建议行羊水穿刺进行产前诊断。有研究认为，NIPT对21-三体综合征、18-三体综合征和13-三体综合征的敏感度和特异度明显高于血清学筛查，因此，可以有效减少假阳性者及不必要的侵入性产前诊断，并且将其作为出生缺陷防治工作中非常重要的组成部分[12]。考虑NIPT存在假阳性和假阴性可能，且对其他染色体检出率较低[13]，有漏诊可能。本研究结果显示，对于孕中期血清学高风险孕妇，羊水穿刺组染色体异常检出率为3.11%，NIPT组为1.16%。越来越多产前超声研究发现，胎儿合并有多发性结构畸形时，其出现染色体异常风险大，即超声结构异常与胎儿患染色体病风险密切相关[14-15]。有研究报道，胎儿超声异常者行羊膜腔穿刺，染色体异常核型发生率为11.54%～16.9%[16-17]。段红蕾等[18]对4 915例不同产前诊断指征孕妇行胎儿染色体核型分析发现，对于超声提示胎儿结构异常者采用NIPT进行二线筛查时，漏诊最多。本研究结果显示，对于B超结构异常孕妇，羊水穿刺组染色体异常检出率为7.27%，NIPT组为4.55%，提示在产前B超异常者中，NIPT不能取代羊水穿刺进行染色体异常检查，存在检出率及检测范围的局限性。

本研究对其他产前诊断指征如不良孕产史、孕期用药、宫腔感染等行羊水穿刺和无创DNA检查，未检测出胎儿染色体异常。考虑可能因临床样本量不足所致，有待进一步完善。

综上所述，不同产前诊断指征孕妇行羊水穿刺对胎儿染色体异常的检出率明显高于NIPT。羊水穿刺仍是染色体核型诊断“金标准”，可发现分辨率内所有染色体数目与结构异常情况，较准确且全面，是首选的产前诊断方法。羊水穿刺提示胎儿染色体异常时，可及时终止妊娠，并可为再次妊娠提供遗传咨询指导意见。NIPT对胎儿21三体综合征、18三体综合征和13三体综合征的检出率较高，适用于错过孕中期血清学筛查或筛查为临界风险者、羊水穿刺禁忌者等。NIPT作为筛查方法存在假阳性及假阴性情况，且对其他染色体异常的检出率有限，因此，具备产前诊断指征的孕妇应慎用NIPT。