基于尿液代谢组学的冠心病血瘀证模型大鼠生物学基础研究

李静 ，钟森杰，李亮，吴华英，资源，袁志鹰，黄惠勇

1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学中医诊断研究所，湖南 长沙 410208；3.衡阳市中医医院，湖南 衡阳 421001

冠状动脉粥样硬化性心脏病（coronary atherosclerotic heart disease，CHD）是指因冠状动脉发生粥样硬化或痉挛引起管腔闭塞或狭窄，导致心肌缺血、缺氧或坏死而引发的心脏病变[1]。据统计，在我国CHD 是死亡率最高的疾病[2]。CHD 属中医学“胸痹”“心痛”等范畴，属本虚标实之证，本虚为气血阴阳亏虚，标实为寒凝、血瘀、痰浊、气滞等，而血瘀证是CHD 中最常见的证型之一[3-4]。CHD 血瘀证主要表现为胸部刺痛、绞痛，固定不移，痛引肩背或臂内侧，胸闷，心悸不宁，唇舌紫黯，或有瘀斑，舌下络脉青紫，脉沉涩或结代[5]。

代谢组学是系统生物学研究的重要组成部分，分析技术具有高通量、高灵敏度、高精确度的特点，使生物体内源性代谢物质变化规律与疾病生理病理变化相契合[6]。代谢组学研究思路具有整体性、动态性和系统性的特点，与中医学的哲学思想具有一致性[7]。因此，本研究以CHD 血瘀证模型大鼠为研究对象，运用超高效液相色谱-质谱联用（UPLC-QE-MS）代谢组学技术进行检测，分析CHD 血瘀证模型大鼠尿液内源性代谢物及代谢通路的变化，以期从代谢组学角度阐明CHD 血瘀证潜在的生物学基础，为CHD 有效防治提供新思路。

1 材料和方法

1.1 动物

SPF 级雄性SD 大鼠20 只，体质量（220±20）g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物许可证号SCXK（湘）2019-0004。分笼饲养于湖南中医药大学实验动物中心SPF 级动物房，温度22～26 ℃，相对湿度40%～65%。适应性饲养1 周后开始实验。

1.2 药物、试剂与仪器

注射用青霉素钠（80 U/支，华北制药股份有限公司，批号20190418），盐酸利多卡因注射液（5 mL，0.1 g/支，国药集团容生制药有限公司，批号20190618）。甲醇（批号67-56-1，CNW Technologies），乙腈（批号75-05-8，CNW Technologies），乙酸铵（批号 631-61-8，CNW Technologies），氨水（批号1336-21-6，CNW Technologies）。小动物呼吸机-220V（深圳市瑞沃德生命科技有限公司），P150 型16 通道多导电生理记录仪（美国BIOPAC 公司），Vanquish型超高效液相色谱仪（Thermo Fisher Scientific），Q Exactive HFX 型高分辨质谱仪（Thermo Fisher Scientific），BSA124S-CW 天平（Sartorius），Heraeus Fresco17 离心机（Thermo Fisher Scientific），D24UV纯水仪（Merck Millipore），PS-60AL 超声仪（深圳市雷德邦电子有限公司）。

1.3 分组与造模

20 只大鼠按随机数字表法分为假手术组、CHD血瘀证模型组，每组10 只。CHD 血瘀证模型组大鼠参考文献[8-9]方法，采用结扎左冠状动脉前降支方法制备CHD 血瘀证模型。CHD 血瘀证模型组大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，背位固定，颈部消毒，暴露气管，连接小动物呼吸机，行气管插管，设置呼吸频率85 次/min，潮气量8～10 mL/kg，呼吸比为2∶1。大鼠机械通气正常后，于左侧第3、4 肋间切开皮肤，钝性分离，充分暴露心脏，用6-0 带线缝合针在左心耳与肺动脉圆锥交界稍下约2～3 mm 处结扎左冠状动脉前降支，以结扎部位以下心肌变白、搏动减弱且心电图表现为ST 段弓背抬高或/和T 波高耸或与其形成单向曲线为造模成功。关闭胸腔，缝合伤口。术后连续3 d 肌肉注射青霉素钠预防感染。假手术组开胸后，只穿线不结扎，其余步骤同CHD 血瘀证模型组。大鼠自由饮水，正常进食。

1.4 观察指标

1.4.1 HE 染色

造模成功后第3 日处死大鼠，开胸取心肌组织，4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，连续切片，依次脱水，行HE 染色，光学显微镜下观察心肌形态。

1.4.2 尿液代谢组学检测

造模成功后第3 日7:00 轻提大鼠尾根部，按摩膀胱，多次采集大鼠晨尿样本，用尿液存储器迅速收集尿液，过滤，分装至1.5 mL EP 管，4 ℃、1000 r/min离心5 min，取上清液，并移至冻存管，液氮速冻30 s后取出，置于-80 ℃冰箱保存。样本4 ℃融化，进行上机检测前处理：①根据样品渗透压，加入一定体积的水；②加入400 μL 提取液[（甲醇∶乙腈＝1∶1（V/V），含同位素标记内标混合物）]，涡旋混匀30 s；③超声10 min（冰水浴）；④-40 ℃静置1 h；⑤将样品4 ℃、12 000 r/min 离心15 min；⑥取上清液于进样瓶中上机检测；⑦所有样品另取等量上清，混合成质控样品上机检测。

UPLC-QE-MS检测条件：采用Vanquish超高效液相色谱仪，通过WatersACQUITY UPLCBEH Amide 液相色谱柱（2.1 mm×100mm，1.7μm）对目标化合物进行色谱分离。流动相A为水相，含25mmol/L乙酸铵和25mmol/L氨水，B为乙腈。采用梯度洗脱：0～0.5 min，95%B；0.5～7 min，95%～65%B；7～8 min，65%～40%B；8～9 min，40%B；9～9.1min，40%～95%B；9.1～12 min，95%B。流速：0.5mL/min；柱温：25℃；样品盘温度：4℃；进样体积：3μL。

1.5 数据处理

ThermoQExactive HFX 质谱仪能在控制软件（Xcalibur，Thermo）控制下进行一级、二级质谱数据采集。经UPLC-QE-MS检测，得到原始数据，利用ProteoWizard 软件转成mzXML格式后，使用自主编写的R程序包（内核为XCMS）进行峰识别、峰提取、峰对齐和积分等处理，然后与BiotreeDB（V2.1）自建二级质谱数据库匹配进行物质注释，算法打分的Cutoff 值设为0.3。

1.6 统计学方法

使用SIMCA 软件（V15.0.2）对原始数据进行对数转换加中心化（CTR）格式化处理，然后进行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA）。以t检验P＜0.05和VIP＞1.5为条件，筛选潜在内源性差异代谢物。运用Metabo Analyst4.0（https://www.metaboanalyst.ca/）通路软件，利用鉴定出的差异代谢物KEGG ID进行通路富集分析，以原始P＜0.05为条件，筛选出富集显著的代谢通路。采用SPSS24.0统计软件进行分析，实验数据以表示，符合正态分布及方差齐性者采用独立样本t检验，不符合则采用秩和检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HE 染色结果

假手术组大鼠心肌细胞横纹清晰，排列整齐，细胞核清晰，多呈椭圆形，细胞质染色均匀，未见血管扩张及炎细胞浸润；CHD血瘀证模型组大鼠心肌细胞排列紊乱，心肌纤维化粗大，细胞核边缘不清，可见血管扩张，淋巴细胞浸润。见图1。

2.2 尿液正负离子基峰谱图

在正负离子模式下，尿液样本经UPLC-QE-MS检测后，绘制代表性尿液正负离子基峰谱图，见图2。

2.3 代谢轮廓分析

2组大OPLS-DA 代鼠尿液样本在谢轮廓分析正负离子模，获得相应式下，经P得分图。PC CA 和A 得分图见图3，样本在二维空间上表现出分离状态，无重叠部分，反映2组大鼠尿液样本代谢轮廓的改变。OPLS-DA 得分图见图4，样本呈对称分布，2组间分离明显，表明2组样本存在显著差异，提示建模后大鼠机体正常生理代谢受影响。

图1 2 组大鼠心肌组织形态（HE染色，×200）

图2 2 组大鼠尿液样本正负离子模式基峰谱图

2.4 差异代谢产物筛选

以VIP＞1.5、P＜0.05为筛选条件，最终得到36种组间差异代谢物。与假手术组比较，CHD血瘀证模型组甘油、L-硒代蛋氨酸、尿嘧啶含量增加，N-乙酰基-L-天门冬氨酸、丙氨酰亮氨酸、D-丙氨酸、氨基葡萄糖6-磷酸、D-核糖5-磷酸、缬氨酸赖氨酸、丙氨酰谷氨酸、赖氨酰缬氨酸、草酰乙酸、丙酮酸、缬氨酸、D-木酮糖、脯氨酰脯氨酸、5’-磷酸吡哆醛、4-乙酰氨基丁酸、假尿苷、D-核糖、尿酸、海藻糖、1H-吲哚-3-甲醛、5-磷酸-α-D-核糖1-二磷酸、α-D-核糖1,2-环磷酸盐5-磷酸盐、脱氧腺苷、泛酸、N-乙酰丙酮酰谷氨酸、D-木糖醇、磷酸烯醇丙酮酸盐、乳糖、L-硒代半胱氨酸、硒代胱氨酸、5-氨基咪唑-4-羧酰胺、D-葡糖醇-1,5-内酯6-磷酸盐、磷酸甘油含量减少，代谢产物信息详见表1。

图3 2 组大鼠尿液液正负离子模式PCCA 得分图

图4 2 组大鼠尿尿液正负离子模式式OPLS-DA 得分图图

表1 2组组大鼠尿液差异代代谢物

2.5 显著代谢通路分析

为进一步探讨差异代谢物与CHD 血瘀证的关系，运用Metabo Analyst4.0通路软件进行生物代谢通路富集及拓扑分析，代谢通路分析概要图见图5。以原始P＜0.05为筛选条件，鉴定涉及9条显著代谢通路：丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，磷酸戊糖途径，糖酵解/糖异生，泛酸和辅酶A（CoA）生物合成，柠檬酸盐循环（TCA 循环），丙酮酸代谢，嘌呤代谢，甘油脂代谢，戊糖和葡萄糖醛酸酯的相互转化。差异代谢物代谢通路具体信息见表2。

图5 代谢通路分析概要图

表2 显著代谢通路具体信息

3 讨论

代谢组学作为系统生物学研究的重要组成部分，直接反映疾病病理过程代谢化合物的共性和特征性指标，能在区分疾病模型上发挥独特作用[10]。尿液样本所含的信息丰富，采集样本具有无创性、可重复性，因此，尿液在代谢组学研究中具优势[11]。本研究结果显示，与假手术组比较，CHD血瘀证模型组大鼠尿液中代谢产物含量紊乱，筛选出36个代谢标志物，涉及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，磷酸戊糖途径，糖酵解/糖异生，泛酸和CoA 生物合成，柠檬酸盐循环（TCA 循环），丙酮酸代谢，嘌呤代谢，甘油脂代谢，戊糖和葡萄糖醛酸酯的相互转化等显著代谢通路。

其中3条糖代谢通路分别为磷酸戊糖途径、戊糖和葡萄糖醛酸酯的相互转化、糖酵解/糖异生。磷酸戊糖途径通路包括D-核糖5-磷酸、D-核糖、D-葡糖醇-1,5-内酯6-磷酸盐、5-磷酸-α-D-核糖1-二磷酸。磷酸戊糖途径是机体糖代谢的重要途径之一，是葡萄糖氧化分解的重要方式，以6-磷酸葡萄糖为起点，直接进行脱氢和脱羧反应，生成大量NADPH 和磷酸核糖，为体内多种代谢供氢体和碳源[12]。戊糖和葡萄糖醛酸酯的相互转化通路包括D-木酮糖、D-木糖醇。葡萄糖醛酸形成木酮糖，可与磷酸戊糖途径相连，研究表明戊糖和葡萄糖醛酸酯的相互转化通路与轭合反应有关[13]。糖酵解/糖异生通路有丙酮酸、磷酸烯醇丙酮酸盐、草酰乙酸、磷酸甘油参与。心脏缺氧时，ATP生成减少，糖酵解途径通过加强底物磷酸化，糖酵解途径通过加强底物磷酸化以生成ATP，从而补充心肌能量的不足[14]。糖异生通路是生物合成葡萄糖的重要途径，以补充糖供应的不足。已有研究表明，心肌缺血状态下，蛋白质功能产能不足，通过糖代谢分解产生能量以此供应心肌[15]。以上研究表明，CHD血瘀证病理过程中存在多条糖代谢紊乱，提示糖氧化供能障碍，机体处于磷酸戊糖途径、戊糖和葡萄糖醛酸酯的相互转化、糖酵解/糖异生等糖代谢途径过度激活的应急代谢状态。

丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸通路包括N-乙酰基-L-天门冬氨酸、N-乙酰丙酮酰谷氨酸、草酰乙酸、丙酮酸、氨基葡萄糖6-磷酸参与。丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸途径经过氨基化的底物为丙酮酸、草酰乙酸、α-酮戊二酸。有研究表明，草酰乙酸是TCA 循环的起点，α-酮戊二酸是TCA 循环的重要中间产物，丙酮酸参与TCA 循环的回补反应，维持TCA 循环的进行[16]。因此，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸通路异常将影响丙酮酸、草酰乙酸、α-酮戊二酸，最终影响TCA循环。本研究也发现丙酮酸代谢和TCA 循环通路的紊乱。冠状动脉粥样硬化引起心肌缺氧，使心肌能量发生代谢障碍，而TCA循环途径异常则是能量代谢紊乱的标志[17]。心脏能量利用率低下，需氧量增加，因此出现心率加快、呼吸不畅、胸闷胸痛等表现。

泛酸、缬氨酸、尿嘧啶参与泛酸和CoA 生物合成途径，其中泛酸、缬氨酸含量减少，尿嘧啶含量增加。泛酸是CoA 生物合成的重要前体物质之一，并参与生物体内氨基酸类、糖类、脂类、蛋白质类的能量代谢。研究表明，泛酸对脂质过氧化损伤的细胞和大鼠具有保护作用[18]。本实验结果显示，当CHD 血瘀证发生时，由于泛酸和缬氨酸含量降低，导致生物体内CoA 合成减少，引起相关代谢途径紊乱。甘油、磷酸甘油参与甘油脂代谢，其脂代谢异常视为CHD发病的危险因素之一。脂代谢异常时，动脉内膜细胞功能发生改变、受损，脂质物质在血管内皮下沉积引起动脉粥样硬化[19-20]。有研究表明，脂代谢异常引起血液黏度增高等血液流变学变化是CHD 血瘀证微观辨证的重要指标[21]，与本研究结果一致。

嘌呤代谢途径有D-核糖5-磷酸、5-磷酸-α-D-核糖1-二磷酸、脱氧腺苷、5-氨基咪唑-4-羧酰胺参与。嘌呤代谢途径经嘌呤碱基最终分解生成尿酸，是人体嘌呤代谢的终末产物。生成尿酸部位主要是血管壁，特别是血管内皮细胞，尿酸含量减少，在血管壁上沉积，损伤血管内膜，引起脂质过氧化反应和低密度脂蛋白胆固醇的氧化，导致冠状动脉粥样硬化加重[22]。

本研究利用代谢组学技术检测分析，揭示了CHD血瘀证潜在的生物学基础，病理机制涉及能量代谢失衡及氨基酸代谢、糖代谢、嘌呤代谢紊乱，脂质堆积等多个层面，提示CHD 血瘀证发病的复杂病理过程，为疾病早期预测和临床诊断提供了依据。