自发性蛛网膜下腔出血早期脑损伤中自噬的研究进展*

米 杨，谭 赢，张继勤 综述，尹 浩△ 审校

(1.贵州医科大学研究生院，贵阳 550025；2.贵州省人民医院神经外科，贵阳 550002；3.贵州省人民医院麻醉科，贵阳 550002)

自发性蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)是脑血管破裂出血并渗到蛛网膜下腔的神经系统急症，其中动脉瘤性SAH(aSAH)占50%～80%[1-2]。既往研究发现，SAH后脑血管痉挛(cerebral vasospasm，CVS)是影响患者预后的关键因素，经过治疗的SAH患者中，30%～70%会发生CVS导致脑缺血[3]。虽然应用内皮素-1(ET-1)受体拮抗剂可以降低CVS发生率，但病死率和预后没有显著变化[4]。这表明SAH后CVS并不是影响患者预后的唯一因素。有学者认为，在SAH早期阶段脑组织更容易受损，表明早期脑损伤(early brain injury，EBI)可能是导致患者致残甚至死亡的另一重要原因，包括神经炎症和微血管功能障碍等损伤[5]。SAH后脑损伤分为EBI和延迟性脑缺血(delayed cerebral ischemia，DCI)。EBI指SAH最初72 h内发生的病理生理变化，而DCI指3～14 d内的缺血性损伤[6-7]，EBI包括短暂脑缺血、血脑屏障损坏、血管痉挛、代谢衰竭、炎症和氧化应激的发生等[8-9]，都会对神经元造成损伤[10]，而自噬可以在EBI发挥重要作用，包括维持内环境稳定[11]、降低细胞凋亡水平[12]、减轻脑水肿等，合理应用自噬可能为治疗SAH带来新的方向。

1 自噬与EBI相关信号通路

自噬一词源于希腊语中的“自我”和“进食”，意为细胞通过溶酶体降解细胞内的物质，提供新的物质用于维持细胞的内稳态[13]。在实验性SAH模型中，自噬可以对EBI包括脑水肿、血脑屏障损伤、神经细胞凋亡等损伤进行改善[14]。研究表明，自噬可能由多种信号传导通路共同调控，这些通路错综复杂，在哺乳动物中，已发现雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路、活性氧(ROS)、核转录因子-κB(NF-κB)、Beclin-1、Ras/蛋白激酶A(PKA)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)等信号传导通路均可能介导自噬的发生，而mTOR、ROS作为多条信号传导通路的交叉点，是调控自噬的关键因素。

1.1 腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/mTOR信号通路

自噬的特点是形成称为自噬体的双膜小泡，将细胞质物质降解，为细胞在能量缺乏状态下提供新的营养物质[15]。AMPK是哺乳动物细胞中能量状态的主要感受器，其通过感知一磷酸腺苷/三磷酸腺苷(AMP/ATP)和二磷酸腺苷(ADP)/ATP比值从正、反两个方面调节细胞的能量状态[16]，一方面促进生成ATP的分解代谢过程，另一方面抑制消耗ATP的合成代谢过程[17-18]。其中，细胞生长和蛋白质翻译是细胞ATP消耗的主要原因，mTOR作为自噬多条信号传导通路的交叉点，具有调节蛋白质合成和细胞周期进程的作用，AMPK抑制蛋白质合成的能力是通过直接抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mTORC1)来实现的。在结节硬化综合征(TSC)细胞中，AMPK磷酸化TSC2并激活TSC，从而衰减 mTORC1途径。此外，AMPK通过磷酸化Ser15来稳定细胞内促凋亡蛋白p53，mTORC1的活化增强p53的翻译，两种效应共同作用致使p53在葡萄糖缺乏的TSC细胞中聚集，促使细胞凋亡。研究证明，自噬激活剂雷帕霉素对TSC缺陷细胞中mTORC1的抑制可以维持细胞内ATP水平，并在能量缺乏时抑制AMPK的激活，完整AMPK-TSC信号传导对于抑制mTORC1通路在能量压力条件下调控细胞存活和生长是必要的[19]。在EGAN等[20]的研究中，同样揭示了能量感应和自噬核心蛋白自噬激活激酶1(ULK1)之间的联系，研究表明当细胞应激时，AMPK可以磷酸化ULK1并使其发挥功能，从而触发自噬级联的启动，而mTORC1通过抑制ULK1的磷酸化而抑制自噬的启动。可见AMPK既通过直接激活磷酸化ULK1激活自噬，同时抑制mTORC1的活性，解除mTORC1对ULK1的抑制，从正、反向同时促进自噬的激活。此外，在细胞中还存在一种自噬体形成的关键膜标记蛋白Vps34，哺乳动物的Vps34存在于不同的复合物中，通过 AMPK的差异调节，可以调节自噬的起始，这是因为AMPK可以通过ATG14L逆转AMPK对Vps34-Beclin-1复合物活性的抑制作用，经AMPK直接磷酸化Beclin-1，进而激活自噬前体Vps34复合物，促使自噬形成[6，21]。而自噬经由AMPK通路激活后缓解EBI的神经细胞损伤作用已在LI等[22]的实验中得到了证实。

1.2 PI3K/Akt信号通路

细胞中酪氨酸激酶可以在生长因子、细胞因子等刺激下被激活，经过一系列过程最终激活PI3K，PI3K可以将4,5二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)转化为3,4,5三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)，而10号染色体上缺失的磷酸酶与张力蛋白同源物基因(PTEN)可负性调控PI3K-Akt信号通路致使PI3K的D3位去磷酸化生成PIP2。生成的PIP3使Akt从细胞质转移到细胞膜上，然后血小板-白细胞C激酶与PIP3共同导致Akt构象改变，同时使Thr308和Ser743磷酸化，这些使Akt激活，进而抑制细胞凋亡并通过抑制半胱氨酸蛋白酶-9(caspase-9)活性阻止凋亡级联反应的激活[23]。另外，mTOR作为Akt的下游分子，结节性脑硬化复合物-1(TSC-1)和TSC-2形成二聚体复合物抑制mTOR的功能，但是活化的Akt可以抑制TSC-1/TSC-2复合物的形成，而解除其对mTOR的抑制功能，使mTOR激活；Akt也可以直接作用mTORC1使mTOR激活。激活的mTOR调控核糖体S6蛋白激酶(S6K)、真核生物启动因子4E结合蛋白1(4E-BP1)，对特定的mRNA翻译及蛋白质合成进行调控[24]。YU等[25]研究表明，P13K/Akt通路激活在减轻SAH诱导的脑损伤方面具有重要作用；而SUN等[26]研究中对大鼠SAH模型给予κ阿片受体激动剂Salvinorin A，在EBI期可改善神经元凋亡，同时Bax和半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)表达下调，表明自噬可能通过PI3K/Akt信号通路参与EBI。

1.3 ROS信号通路

SAH作为一种神经系统急症，其发生时会产生一系列可以氧化蛋白质、脂类及核酸等物质的ROS分子，这些ROS分子在SAH的EBI阶段可发挥激活自噬的作用。当细胞受到外界损伤刺激时，约90%的ROS由线粒体内膜呼吸链产生超氧自由基形成，随着细胞内产生ROS并逐渐累积增多，为维持细胞内稳态，激活缺氧诱导因子1(HIF1)并产生转录物质腺病毒E1B19000相互作用蛋白3(BNIP3)和类腺病毒E1B19kD蛋白相互作用蛋白3同源物(NIX)，它们的翻译蛋白与线粒体膜上的Beclin-1竞争结合Bcl-2，从而释放自噬的重要分子Beclin-1并介导自噬激活。在氧化应激或缺氧状态下，内质网压力感受器被激活，其下游可促进自噬基因LC3和ATG5表达并激活自噬。除上述途径外，氧化应激还可以激活FOXO3和NRF2，FOXO3刺激LC3和BNIP的表达，NRF介导p62的转录，p62转录的同时促进NRF2的转录。所有的转录活动都能正向调节自噬的发生。抑癌基因p53可以转录激活许多自噬相关基因。在这些基因中，调控DNA损伤的自噬分子(DRAM)和Sestrins基因对自噬起正向激活作用，而这些基因与ROS之间的关系并不明确。在p53激活的基因中，TP53诱导的糖酵解和凋亡调节因子(TPGAR)作为一种p53靶点的蛋白，负向调节自噬，表明其作用与p53无关。同时，ROS抑制ATG4蛋白酶的活动进而促进自噬小体的形成[27]。而在CHEN等[28]的研究中发现，自噬可以由褪黑素激活进而减轻EBI，减少神经细胞凋亡。由此可见，EBI可以释放一系列ROS对神经细胞造成损伤，同时也可以通过自噬的激活保护神经细胞免于凋亡。

2 自噬参与SAH的EBI阶段

研究表明，SAH后的EBI阶段，Beclin-1及其他相关指标表达显著升高，在电镜下可发现多膜胞质空泡、核收缩、线粒体肿胀和自噬小泡等，表明受损神经细胞内自噬溶酶体途径激活[29-30]。此外，EBI后内质网内的钙离子释放进入细胞质内，钙离子浓度升高通过1,4,5-三磷酸肌醇受体(IP3R)激活钙调蛋白依赖性蛋白激酶(CaMKK)/AMPK通路，解除mTOR对ULK1复合物的抑制作用，单独使用钙离子动员剂使细胞内钙离子浓度升高仍可促进自噬激活[29-30]。电镜观察发现，SAH后溶酶体完整性被破坏，致使细胞内损坏的线粒体聚集，同时激活自噬。

2.1 自噬与EBI的氧化应激

SAH伴随而来的氧化应激可产生ROS，对蛋白质、脂质和核酸都有毁灭性损伤；此外，存在于蛛网膜下腔的血液降解为高铁血红蛋白、血红素等物质，参与EBI[31-33]，这些ROS物质随着脑脊液的流动而遍布整个中枢神经系统[34]，同时激活自噬进而减轻EBI带来的神经细胞凋亡[28]。FUMOTO等[35]研究显示，在SAH模型中应用依达拉奉后可以阻止基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达和激活，并减少血脑屏障的主要构成因素紧密连接蛋白的降解，这在应用其他抗氧化剂的实验中亦得到了验证[36]。除紧密连接以外，血管内皮细胞也是构成血脑屏障的重要成分，FUMOTO等[35]同时发现内皮细胞的凋亡水平下降并可维持内皮细胞屏障功能，这种预防作用间接表明氧化应激可以介导EBI内皮细胞凋亡。

2.2 自噬与EBI的神经炎症

LC3是自噬体的生物标记物，Beclin-1是一种在自噬中有重要作用的Bcl-2相互作用蛋白。LC3和Beclin-1被普遍认为是自噬的标记物，在自噬体形成过程中表达增加，同时刺激一种细胞溶酶体降解酶组织蛋白酶D(cathepsin D)的表达。LEE等[30]研究发现，在SAH后24 h内，LC3-Ⅱ、Beclin-1和cathepsin D水平逐渐上升；WANG等[14]同样证实了自噬的激活，并表明自噬在24 h达到峰值，在48 h逐渐恢复正常水平，缓解了EBI对神经细胞的损伤。在神经炎症方面，促炎性晚期糖基化终产物受体(the receptor for advanced glycation end products，RAGE)在EBI中具有调节自噬和凋亡的作用，抑制RAGE可显著增加SAH后caspase-3和bax的裂解水平，并降低Bcl-2水平。阻断RAGE可减少SAH引起的LC3-Ⅱ和Beclin-1上调，并减少神经炎性细胞因子，表明RAGE在神经炎症方面同样有调节作用，NF-κB借助RAGE途径刺激神经炎性介质发挥主导作用[37]。在SAH后24 h抑制RAGE可以阻止小胶质细胞的活化及肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素(IL)-1β和环氧合酶-2(COX-2)的释放，而RAGE被阻断时，caspase-3和bax水平升高，LC3和Beclin-1水平降低，表明抑制RAGE将促进细胞的凋亡并抑制自噬特异因子的表达[38]。RAGE对于SAH后神经细胞凋亡与自噬之间的平衡反馈，可为改善SAH预后提供潜在的靶点。

2.3 自噬的激活与抑制

在实验性SAH模型中，应用雷帕霉素(一种自噬激活剂)的小鼠早期LC3和Beclin-1水平显著升高，24 h达高峰，其临床行为量表上的改善优于对照组SAH大鼠；而应用3-甲基腺嘌呤(一种自噬抑制剂)的小鼠与前者正好相反，其神经功能缺损加重，表明自噬的激活对EBI有一定的修复作用[14]。在改良SAH模型中，也发现使用3-甲基腺嘌呤或渥曼青霉素治疗会降低大鼠神经功能评分，增加神经元凋亡，而雷帕霉素和预防性辛伐他汀联合应用可提高自噬活性，抑制细胞凋亡[39]。在这个过程中，自噬激活可以抑制线粒体凋亡途径，减少了神经细胞凋亡，从而有效地改善EBI[40]。自噬的另一种激活剂褪黑素同样可以降低caspase-3的活性和凋亡活性，包括提高LC3-Ⅱ/LC3-I比值，表明褪黑素激活自噬可改善SAH后大鼠细胞的凋亡，进而支持了自噬对EBI的保护作用[28]。

3 小 结

本文重点阐述了自噬在SAH后EBI阶段发挥的重要作用，自噬激活可以保护神经细胞免于凋亡进而减轻SAH造成的脑损伤，而调控自噬的主要信号通路是AMPK/mTOR信号通路，自噬激活剂可能通过磷酸化ULK1蛋白触发自噬级联反应的启动，为SAH患者预后提供了新方向。适当的自噬激活可以为SAH患者带来有益的方面，而长期自噬状态的持续和过度的自噬均会导致神经细胞发生程序性死亡，给神经功能带来一定的损伤。为此，需要更深入的研究自噬在EBI的作用机制，通过RAGE这样潜在的靶点调控凋亡与自噬之间的平衡，使SAH后自噬朝着有利的方向发展。自噬参与SAH神经保护像一把双刃剑，必须在激活自噬的同时并对自噬进行控制，使其在整个疾病的过程中发挥有益的作用而避免对神经细胞的损伤，故选择适合的激活剂与自噬的调控靶点是下一步研究方向。因此，需要更深入地研究SAH和自噬调控的具体机制，并探究二者之间的具体关系，为SAH治疗提供新的策略。