当归多糖对大鼠视网膜缺血-再灌注损伤的保护作用及机制研究

刘宗尧，李 璐，王 辉，刘 娟

视网膜缺血-再灌注损伤的发生涉及病理、生理、免疫、分子生物学等多个学科，在缺血-再灌注过程中，多重因素(炎症反应、钙超载、氧自由基释放、兴奋性氨基酸)共同作用引起细胞凋亡[1-2]。临床上很多患者在视网膜血流恢复灌注后，视力依然没有好转，可见缺血组织再灌注时造成的实质器官及微血管损伤是不可逆的[3]。

当归多糖为中药当归的水溶性提取物，具有增加免疫力、改善心血管功能、促进造血、抗衰老的作用[4-5]。文献报道，当归多糖通过降低视网膜组织Caspase-3表达水平，改善大鼠视网膜神经细胞功能，发挥对青光眼大鼠模型视网膜的保护作用[6]。本实验通过动物实验构建大鼠视网膜缺血-再灌注损伤模型，旨在为临床治疗视网膜缺血再灌注损伤提供药物选择。

1 材料与方法

1.1实验材料 当归多糖(批号：B25568，上海源叶生物)，丙二醛(malondialedhyde, MDA)活性检测试剂盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性检测试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)活性检测试剂盒(上海酶联生物)，4%多聚甲醛(北京雷根生物技术有限公司)，苏木素-伊红染液(上海源叶生物)，核因子E2相关因子2(nucleafactorerythroid-2-relatedfactor2, Nrf2)、血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1, HO-1)抗体(武汉友联特生物技术有限公司)。

1.2实验动物及分组 SD大鼠40只，体重(260±20)g，由哈尔滨医科大学附属第二医院动物实验中心提供，实验动物许可证号：SCXK(黑)2019-001。随机分为对照组、模型组、当归多糖低、高浓度组，每组10只。模型组和当归多糖低、高浓度组大鼠建立视网膜缺血-再灌注损伤模型。当归多糖低、高浓度组在建模前分别给予当归多糖(15 mg/kg、30 mg/kg)腹腔注射，对照组和模型组大鼠建模前腹腔内注射等体积生理盐水，1/d，连续给药2周。

1.3建立大鼠视网膜缺血-再灌注损伤模型 SD大鼠戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后仰卧于操作台上，碘伏消毒颈部，手术刮刀刮除毛发。沿颈正中切口逐层切开皮肤及皮下组织，分离左侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，结扎颈总动脉和颈外动脉，60 min后松开动脉夹，逐层缝合皮下组织及皮肤。在建模过程中，对照组大鼠死亡2只，模型组大鼠死亡2只，当归多糖低、高浓度组大鼠各死亡3只。

1.4HE染色观察大鼠视网膜组织病理形态学变化 大鼠脱臼处死后取左侧视网膜组织，4%多聚甲醛固定1周。二甲苯中浸泡20 min，梯度乙醇冲洗后苏木素染液内浸泡10 min，蒸馏水反复冲洗切片，含1%盐酸的乙醇溶液浸泡10 min，氨水冲洗一次后用伊红染色30 s，中性树胶封片后置于显微镜下拍照。

1.5透射电镜观察视网膜神经节细胞层细胞改变 2.5%戊二醛溶液固定视网膜24 h，醋酸铀染液染色，丙酮脱水，常规电镜包埋，制作超薄切片，采用枸橼酸铅和2%醋酸双氧铀染色，透射电镜观察(×10 000)视网膜神经节细胞形态。

1.6氧化应激指标检测 包括MDA含量及SOD、GSH-Px活性检测，取视网膜组织匀浆后按照试剂盒说明书检测MDA含量及SOD、GSH-Px活性。

1.7Western Blot检测 取100 mg大鼠视网膜组织，低温条件下剪碎并提取蛋白质，行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜后5%的脱脂奶粉溶液4℃封闭2 h，加一抗(稀释浓度1∶1000)过夜，洗膜后室温下孵育二抗(稀释浓度1∶2000)1 h，ECL化学发光法自显影并采集图像，比较不同样本的蛋白相对表达率。

2 结果

2.1大鼠视网膜组织病理改变 对照组大鼠视网膜组织细胞结构正常，细胞数目多，排列紧密。模型组大鼠视网膜细胞分布稀疏，数目减少，视网膜厚度降低。当归多糖低、高浓度组大鼠视网膜厚度逐渐增加，细胞分布较为均匀。见图1。

图1 4组大鼠视网膜组织病理改变(HE×400)对照组为正常大鼠，模型组为视网膜缺血-再灌注损伤模型，当归多糖低、高浓度组分别给予当归多糖15、30 mg/kg

2.2大鼠视网膜神经节细胞电镜下表现 透射电镜观察显示，对照组大鼠视网膜神经节细胞结构完整，细胞核膜光滑完整，染色质均匀，核仁结构清晰。模型组大鼠视网膜神经细胞核肿胀，细胞质基质成分减少，基质密度减低，细胞核染色质稀疏、边集，细胞胞质内空泡形成。当归多糖低、高浓度组大鼠视网膜神经节细胞形态逐渐改善，细胞核形态略规整。见图2。

图2 4组大鼠视网膜神经节细胞电镜病理改变(×10 000)对照组为正常大鼠，模型组为视网膜缺血-再灌注损伤模型，当归多糖低、高浓度组分别给予当归多糖15、30 mg/kg

2.3当归多糖对MDA含量及SOD、GSH-Px活性的影响 与对照组比较，模型组大鼠视网膜组织中MDA含量升高，SOD、GSH-Px活性降低，差异统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，当归多糖低、高浓度组大鼠视网膜组织中MDA含量下降，SOD、GSH-Px活性升高，且当归多糖高浓度组较当归多糖低浓度组变化更显著，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 4组大鼠视网膜组织MDA含量及SOD、GSH-Px活性比较

2.4Nrf2、HO-1蛋白表达水平比较 与对照组比较，模型组大鼠视网膜组织中Nrf2、HO-1蛋白表达水平显著下降，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，当归多糖低、高浓度组大鼠视网膜组织Nrf2、HO-1蛋白表达显著升高，且当归多糖、高浓度组高于当归多糖低浓度组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3、表2。

表2 4组大鼠视网膜组织Nrf2、HO-1表达水平比较

图3 4组大鼠视网膜组织中Nrf2、HO-1蛋白表达水平对照组为正常大鼠，模型组为视网膜缺血-再灌注损伤模型，当归多糖低、高浓度组分别给予当归多糖15、30 mg/kg；Nrf2为核因子E2相关因子2，HO-1为血红素加氧酶-1

3 讨论

视网膜组织缺血时由于血管内血流中断，具有清除自由基的抗氧化酶类合成不足，加剧了自由基对视网膜的损伤[7]。血液供应恢复后，过量的氧自由基连锁反应介导视网膜细胞毒性，导致视网膜组织中的膜性结构破坏，影响正常视网膜代谢[8]。当归多糖具有减轻自由基毒性、抗衰老、抗血栓、清除自由基、抑制血小板聚集的作用[9]。研究证实，当归多糖通过增强线粒体能量代谢、促进视网膜神经细胞线粒体膜电位上升，对体外培养的成年人视网膜神经细胞发挥保护作用[10]。本研究模拟了临床视网膜缺血再灌注损伤发生发展过程，制备了动物模型，进一步探讨当归多糖对大鼠视网膜组织的保护作用。病理切片及电镜观察结果均显示，当归多糖干预后的视网膜组织结构均匀，细胞坏死程度减轻，表明当归多糖能改善视网膜组织细胞的凋亡。

MDA、SOD和GSH-Px是氧化应激的标志性物质，MDA含量与SOD、GSH-Px水平是相辅相成的[11]。本实验结果显示，与模型组比较，当归多糖低、高浓度组MDA含量显著降低，SOD、GSH-Px活性均显著升高，说明当归多糖降低了视网膜组织的氧化损伤，保护了细胞的完整性。同时当归多糖抑制了细胞内核酸与脂质蛋白质被大量自由基氧化，从而改善视网膜损伤的氧化应激状态。

Nrf2-抗氧化反应元件信号通路参与了机体氧化应激损伤环节，该通路被激活后，Nrf2由细胞质进入细胞核，诱导HO-1基因转录，进而抵抗氧化应激损伤[12]。本实验结果显示，与模型组比较，当归多糖低、高浓度组Nrf2、HO-1蛋白的表达明显升高，且当归多糖高浓度组变化更显著。提示氧化应激激活了Nrf2-ARE信号通路，而当归多糖通过促进抗氧化酶的表达激活Nrf2-ARE信号通路，减轻脂质过氧化反应的发生，保护视网膜组织细胞免受损伤；且随着当归多糖浓度增高，效果更显著。

综上所述，当归多糖可以通过激活Nrf2-ARE信号通路保护大鼠视网膜完整性，缓解大鼠缺血性视网膜损伤。