CXCR4靶向PI3K-Akt信号通路抑制小细胞肺癌血管生成

刘丽丽，吕立丽，谷 雪

小细胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)是起源于支气管黏膜或腺体的一种高度恶性的疾病，占肺癌病例的10%～15%[1]；该病有进展迅速和广泛转移的特征。虽然多达80%的SCLC患者对一线化疗有反应，但大多数最终会复发，预后很差。SCLC患者的5年生存率仅为1%～2%，因此迫切需要新的疗法改善患者状况[2]。

血管生成对肿瘤的生长至关重要[3]，血管内皮生长因子(vascular endothelial groxth factor, VEGF是肿瘤血管生成的关键因素[4]。多项SCLC基因组分析数据表明，PI3K/Akt信号通路显著改变[5-7]。最近证据显示，PI3K/Akt可以通过不依赖HIF-1的机制上调VEGF表达[8-9]。提示PI3K/Akt是SCLC潜在的治疗靶标。CXC趋化因子受体4(CXC chemokine receptor 4, CXCR4)在趋化性和归巢中起重要作用，这是癌症转移的关键步骤。多项研究证据表明CXCR4与血管生成有关[10-11]，它可诱导Akt磷酸化，导致VEGF在mRNA和蛋白水平上表达上调，促进血管生成[12]。因此，本研究拟探究在SCLC中CXCR4是否可通过PI3K/Akt通路干扰VEGF表达抑制肿瘤血管的形成，为其治疗提供新策略。

1 材料与方法

1.1实验动物 选取7～8周龄SPF级雌性裸鼠18只，购自维通利华(北京)实验动物技术有限公司，环境温度为(22±2)℃，湿度(55±15)%，明暗光照循环12 h。小鼠自由进食。

1.2材料 β-actin抗体(ab8226，Abcam)、Akt抗体(ab18785，Abcam)、p-Akt(ab38449，Abcam)、VEGF抗体(ab32152，Abcam)、PI3K抑制剂LY294002(HY-10108,MCE)；PI3K激活剂YS-49(HY-15477，MCE)；CXCR4拮抗剂AMD3100 (ab120718，Abcam)、CXCR4激动剂NUCC-390(HY-111793，MCE)、CD31抗体(ab28364，Abcam)、Matrigel(354234，BD)。

1.3方法

1.3.1人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)复苏与传代培养：按照Piao等[13]的方法从脐带静脉分离和培养HUVEC细胞。

1.3.2免疫蛋白印迹：SCLC细胞系NCI-H446铺于6孔板中，1×106个/孔，分别给予PI3K激活剂YS-49(30 μmmol/L)和PI3K抑制剂LY294002(30 μmmol/L)处理24 h后，经免疫蛋白印迹法检测Akt、p-Akt和VEGF表达水平。免疫蛋白印迹检测步骤如下：经RIPA裂解提取总蛋白，经变性处理，10%分离胶进行SDS-PAGE电泳。将目的蛋白转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h；加入一抗4℃孵育过夜，TBST清洗3次；二抗孵育1 h，TBST清洗3次；滴加显影液，成像系统显影，采集图片，Image J软件进行灰度值分析，以β-actin为内参进行灰度值比较，实验重复3次。SCLC细胞系NCI-H446采用PI3K激活剂(YS-49)、PI3K抑制剂(LY294002)和CXCR4激动剂(NUCC-390)、CXCR4拮抗剂(AMD3100)处理24 h后，经免疫蛋白印迹法检测各组的Akt、p-Akt和VEGF表达水平。

1.3.3小管形成实验： 在 24 孔培养板每孔加入 Matrigel 300 μl，37℃静置1 h后聚合成胶，将HUVEC悬液以2×105个/ml接种于铺有Matrigel胶的24孔板中，500 μl/孔，设对照组、NUCC-390组、AMD3100组。NUCC-390组、AMD3100组分别加入含500 nmol/L的NUCC-390 和100 nmol/L的AMD3100 培养液各500 μl；对照组中加入不含药物的培养液500 μl。置于37℃、5% CO2细胞培养箱培养24 h，光学显微镜下观察内皮细胞小管的形成，每孔随机选取5个视野，数码相机拍照，测量形成的小管长度。

1.3.4SCLC荷瘤小鼠药效评价：每只裸鼠背部接种2×106个NCI-H446，待肿瘤体积达50 mm3左右时，将小鼠分为对照组、NUCC-390组和AMD3100组，每周6只。NUCC-390组和AMD3100组给药剂量为5 mg/kg， 2/d，持续5 d。肿瘤体积计算方式为：肿瘤体积=1/2×a(长径)×b2(短径)。

1.3.5肿瘤血管内皮细胞染色：实验终点安乐死小鼠，剪开背部皮肤，快速剥离肿瘤组织，放入4%多聚甲醛中固定过夜；经脱水、透明和包埋后，行石蜡切片；经CD31 IHC染色标记肿瘤组织内血管内皮细胞，实验步骤参照说明书；染色结果拍照，随机选5个视野，通过IPP软件计算CD31阳性面积。

2 结果

2.1激活PI3K/Akt信号通路对VEGF表达的影响 与对照组相比，YS-49组p-Akt及VEGF表达水平显著性升高，LY294002组p-Akt及VEGF表达水平显著性降低(P<0.05)。见图1。

图1 PI3K/Akt信号通路对SCLC细胞系NCI-H446 VEGF表达水平的调控SCLC为小细胞肺癌，VEGF为血管内皮生长因子；与对照组比较，aP<0.05

2.2CXCR4对PI3K/Akt/VEGF信号通路的影响 与对照组比较，NUCC-390组p-Akt及VEGF表达水平显著升高，AMD3100组p-Akt及VEGF表达水平显著减低(P<0.05)。见图2。

图2 CXCR4对SCLC细胞系NCI-H446 VEGF表达水平的调控SCLC为小细胞肺癌，CXCR4为CXC趋化因子受体4，VEGF为血管内皮生长因子；与对照组比较，aP<0.05

2.3CXCR4对体外小管形成的影响 HUVEC细胞可在Matrigel上形成管状网络结构。与对照组比较，NUCC-390组小管长度显著增高，AMD3100组小管长度显著减低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3、4。

图3 3组HUVEC细胞体外小管长度比较(标尺 100 μm)HUVEC为人脐静脉内皮细胞

图4 3组HUVEC细胞形成的小管长度比较HUVEC为人脐静脉内皮细胞；与对照组比较，aP<0.05

2.4CXCR4对NCI-H446肿瘤生长的影响 与对照组比较，NUCC-390组NCI-H446荷瘤小鼠肿瘤生长速度显著增高，AMD3100组NCI-H446荷瘤小鼠肿瘤生长速度显著性减低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图5。

图5 3组NCI-H446荷瘤小鼠的肿瘤生长速度比较与对照组比较，aP<0.05

2.5CXCR4对NCI-H446荷瘤小鼠肿瘤血管的影响 与对照组比较，NUCC-390组CD31阳性区域面积显著增高，AMD3100组CD31阳性区域面积显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图6、7。

图6 3组NCI-H446荷瘤小鼠肿瘤血管比较(标尺50 μm)

图7 3组NCI-H446荷瘤小鼠肿瘤血管面积比较血管面积为IPP软件中Area值；与对照组比较，aP<0.05

3 讨论

SCLC是肺部恶性肿瘤之一，可分为局限期SCLC和广泛期SCLC。临床确诊的肺癌中有10%～15%是SCLC，70%的SCLC患者就诊时病变范围广，2年生存率仅为3%。20年来临床治疗SCLC进展缓慢，仍在沿用传统化疗方案[14]。因此探寻潜在的新治疗靶点对该疾病的治疗具有重要意义。在肿瘤进展过程中，常伴随病理性血管生成，导致肿瘤微环境中异常血管的形成。肿瘤血管紊乱、曲折、渗漏可导致肿瘤微环境组织内间质压力升高和缺氧，从而促进肿瘤生长[15]。VEGF是VEGF家族的主要成员，是血管生成的主要驱动因素[15]。在肿瘤中VEGF可诱导新血管生成，增加血管通透性，诱导血管内皮细胞迁移和分裂，维持内皮并重新编程血管内皮细胞基因表达谱[16]。因此，在抗肿瘤治疗中抗血管生成已成为越来越有吸引力的靶点。

在SCLC中PI3K/Akt信号通路显著改变[5-6]，而且PI3K/Akt可通过不依赖HIF-1机制上调VEGF的表达，继而促进血管的生成[8-9]。本研究结果显示，与对照组比较，YS-49组p-Akt和VEGF表达水平显著性升高；LY294002组p-Akt和VEGF表达水平显著性降低，表明PI3K/Akt信号通路激活可促进VEGF表达。研究结果表明，PI3K/Akt信号通路可调控VEGF表达，参与肿瘤血管生成过程[8]。

CXCR4为C-X-C趋化因子受体家族的成员，与多种癌症相关。多项研究表明CXCR4与血管生成有关[10-11]。一项针对骨肉瘤患者的临床研究发现，肿瘤组织中CXCR4的表达与VEGF表达呈显著正相关[17]。在弥漫性大B细胞淋巴瘤的临床研究中发现，与健康人相比，患者血清中VEGF和CXCR4的表达水平显著性升高；并且CXCR4表达与VEGF表达呈正相关，提示靶向CXCR4可能成为新的肿瘤治疗策略[18]。此外在乳腺癌的研究中发现，CXCR4可诱导Akt磷酸化，激活导致PI3K/Akt信号通路，可使VEGF蛋白表达上调；相反阻断Akt信号的激活导致VEGF蛋白水平下降[12]。因此推测，在SCLC中CXCR4可通过调节PI3K/Akt信号通路调控VEGF表达，进而抑制肿瘤血管生成和生长。

本研究结果显示，在体外研究中NUCC-390组HUVEC小管长度显著高于对照组，即可显著促进HUVEC小管的形成数量；使用CXCR4拮抗剂AMD3100刺激后，AMD3100组HUVEC小管长度显著低于对照组，即可显著减少HUVEC小管的形成数量；提示CXCR4在体外可调控HUVEC小管的形成。在体内研究中NUCC-390组NCI-H466荷瘤小鼠，肿瘤内血管生成数量及肿瘤体积高于对照组，而AMD3100组肿瘤内血管生成数量及肿瘤体积低于对照组。提示CXCR4激动剂NUCC-390在体内可促进肿瘤及肿瘤血管生长。

综上所述，在SCLC中CXCR4可通过调节PI3K/Akt信号通路调控VEGF表达，进而抑制肿瘤的血管生成和生长;CXCR4抑制剂是一种潜在的抗血管生成疗法。