上调DUXAP10表达对甲状腺癌细胞增殖及凋亡的影响

李 剑，张文谦，姜 力，李延国，刘宏伟

甲状腺癌发病率呈现逐年增长趋势，目前在女性恶性肿瘤发病率中居于第四位;甲状腺癌病情隐匿，早期诊断困难，影像学是筛查的主要手段，缺乏有效的血清学筛查标志物进行广泛的人群筛查[1]。长链非编码RNA参与多种生物过程，包括翻译、转录及染色体修饰等，在恶性肿瘤的发生及发展中具有重要的调控功能;在甲状腺癌细胞的侵袭、增殖、凋亡及耐药等过程中介导了分子生物学机制[2-3]。DUXAP10对多种恶性肿瘤的进展具有促进作用[4-6]，在甲状腺乳头状癌中的作用目前研究并不深入。本研究对甲状腺癌细胞中DUXAP10表达水平进行了检测，并以pcDNA-DUXAP10上调甲状腺癌细胞中DUXAP10表达，观察了增殖、凋亡及细胞周期变化，并初步探讨其机制，为进一步研究DUXAP10在甲状腺癌诊断、预后分析及靶向治疗提供前期研究基础。

1 材料与方法

1.1材料 人甲状腺乳头状癌细胞株(TPC-1、BCPAP)及正常甲状腺滤泡上皮细胞株 (Nthy-ori3-1)均购自中科院上海细胞库，在RPMI 1640培养基(含有10%胎牛血清)中培养。培养环境温度37℃(95%O2、5% CO2)。pcDNA-DUXAP 10及空白对照pcDNA-NC由上海吉加基因公司设计合成。p-Akt抗体、Akt抗体、p-mTOR及mTOR抗体购自美国Sigma公司。实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司，四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测试剂盒购自上海艾博抗贸易有限公司，Annexin V-FITC细胞凋亡及细胞周期检测试剂盒购自上海碧云天生物技术公司。

1.2方法

1.2.1qRT-PCR法：对人甲状腺乳头状癌细胞株及正常甲状腺上皮细胞株进行裂解，采用一步法qRT-PCR试剂盒进行DUXAP10表达检测。首先抽提RNA并对RNA液浓度、纯度及完整性进行验证。然后绘制标准曲线DNA模板后进行DUXAP10实时定量PCR，PCR反应液配置完毕后在RT-PCR仪上扩增。溶解曲线采用2-ΔΔCt法进行分析。

1.2.2pcDNA-DUXAP10转染TPC-1细胞：取对数生长期细胞以胰酶进行消化，直至成为单细胞悬液，24 h后进行转染，细胞接种后观察融合度高于75%后,依照细胞转染试剂盒说明书操作步骤,进行转染，转染后进行24 h培养，以空白对照组(MOCK组)及阴性对照组(pcDNA-NC组)进行对照，qRT-PCR检测转染效率。

1.2.3MTT法检测细胞增殖：取对数期生长细胞，将细胞接种于96孔板，每孔5000个细胞，在37℃培养4 h后,每孔给予20 μl的 MTT液 (5 mg/ml)继续培养，弃去上清液后加150 μl二甲基亚砜(DMSO)，分别在培养24、48、72 h在酶标定量仪上以570 nm波长进行光密度值测定，对重复3次实验的平均值进行统计分析。

1.2.4Annexin V-FITC/PI双染色法检测细胞凋亡：首先对各组细胞进行消化及收集，然后按照试剂盒说明书要求的步骤，以预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞2次、重悬细胞后加Annexin V-FITC 5 μl 和PI 5μl，混匀后避光室温反应10 min，加400 μl 的1×Binding Buffer，混匀后上流式细胞仪，以早期/晚期凋亡细胞百分比例进行凋亡率统计分析，实验重复3次。

1.2.5细胞周期检测：首先对各组细胞进行消化及收集，加入预冷PBS洗涤细胞后进行离心5 min(1000 r/min)，去上清后按照试剂盒操作说明书步骤进行固定过夜，24 h后预冷PBS洗涤并离心后去上清，加入500 μl预冷PI(50 μg/ml)，混匀后避光反应30 min(4℃),PBS洗涤后上流式细胞仪，以3次重复实验结果的平均值进行统计分析。

1.2.6Western blot法：将各组细胞裂解后,按照蛋白抽提试剂盒说明书进行总蛋白抽提。以BCA法定量蛋白浓度，取蛋白50 μg/孔进行上样，以10%的SDS-PAGE进行电泳转移目的蛋白到PVDF膜，蛋白膜漂洗及封膜后进行69 min室温条件下的封闭，吸尽封闭液后加入稀释的Ⅰ抗,继续孵育并回收Ⅰ抗，加入Ⅱ抗,孵育后回收Ⅱ抗，ECL检测蛋白，发光，对灰度值进行分析。

2 结果

2.1DUXAP10在甲状腺癌细胞株中的表达及转染pcDNA-DUXAP10的转染效率检测

2.1.1DUXAP10在甲状腺癌细胞株中的表达比较：TPC-1及BCPAP细胞株中DUXAP10的表达高于Nthy-ori 3-1细胞株(P<0.01)。见图1。

图1 DUXAP10在甲状腺癌细胞株及正常甲状腺细胞中的表达水平比较TPC-1、BCPAP为人甲状腺乳头状癌细胞株，Nthy-ori3-1为正常甲状腺滤泡上皮细胞株；与Nthy-ori3-1细胞比较，aP<0.01

2.1.2甲状腺癌细胞株TPC-1转染pcDNA-DUXAP10的转染效率检测比较：转染pcDNA-DUXAP10组DUXAP10表达显著高于MOCK组及pcDNA-NC组(P<0.01)，其中DUXAP10表达水平较上述2组提高了约5倍。见图2。

图2 甲状腺癌细胞株TPC-1转染pcDNA-DUXAP10的转染率比较MOCK组为空白对照组，pcDNA-NC组为阴性对照组；与MOCK组比较，aP<0.01；与pcDNA-NC组比较，bP<0.01

2.2上调DUXAP10表达对TPC-1细胞增殖的影响 与pcDNA-NC组比较，在24、48、72 h时pcDNA-DUXAP10组TPC-1细胞增殖增高(P<0.01，P<0.05)。见图3。

图3 上调DUXAP10表达对甲状腺癌TPC-1细胞增殖的影响pcDNA-NC组为阴性对照组；与pcDNA-NC组比较，aP<0.01，bP<0.05

2.3上调DUXAP10对TPC-1细胞凋亡的影响 与pcDNA-NC组比较，pcDNA-DUXAP10组TPC-1细胞凋亡率显著减低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图4。

图4 流式细胞术检测上调DUXAP10对甲状腺癌TPC-1凋亡的影响pcDNA-NC组为阴性对照组；与pcDNA-NC组比较，aP<0.05

2.4上调DUXAP10对TPC-1细胞周期的影响 pcDNA-NC组与pcDNA-DUXAP10组TPC-1细胞G0/G1期细胞比例分别为(67.69±3.72)%和(51.28±2.26)%，比较差异均有统计学意义(P<0.01)。pcDNA-NC组与pcDNA-DUXAP10组TPC-1细胞中G2/M期细胞比例分别为(7.51±1.06)%和(9.87±1.03)%，比较差异均有统计学意义(P<0.05)。pcDNA-NC组与pcDNA-DUXAP10组TPC-1细胞S期细胞比例分别为(32.24±1.65)%和(23.53±1.94)%，比较差异均有统计学意义(P<0.01)。

2.5上调DUXAP10表达对甲状腺癌TPC-1细胞Akt/mTOR通路的影响 与pcDNA-NC组比较，pcDNA-DUXAP10组TPC-1细胞的p-AKT/Akt比例及p-mTOR/mTOR比例均升高，差异有统计学意义(P<0.01)。见图5。

图5 上调DUXAP10对2组甲状腺癌TPC-1细胞Akt/mTOR通路的影响A.2组甲状腺癌TPC-1细胞Akt/mTOR通路蛋白免疫印迹图；B.2组甲状腺癌TPC-1细胞p-Akt/Akt表达水平比较；C.2组甲状腺癌TPC-1细胞p-mTOR/mTOR表达水平比较；pcDNA-NC组为阴性对照组；与pcDNA-NC组比较，aP<0.01

3 讨论

甲状腺乳头状癌在甲状腺癌中最常见，病灶大部分体积较小，术前诊断较为困难，总体预后较好[7]。长链非编码RNA在多种肿瘤发生、发展中的研究已成为热点，虽然缺乏编码蛋白的能力但是具有重要的转录活性，并具有转录后调控等功能，对恶性肿瘤的转移、侵袭及增殖等行为具有调控作用。DUXAP10在非小细胞肺癌组织中高表达，对肺癌细胞增殖具有促进作用[8]。在卵巢癌组织中DUXAP10为高表达，并与卵巢癌不良临床病理特征具有相关性，提示预后差[5]。

本研究结果显示，DUXAP10在甲状腺癌细胞株TPC-1及BCPAP中表达高于正常甲状腺滤泡上皮细胞。这表明DUXAP10可能和甲状腺癌细胞的恶性生物学行为有关。文献报道，DUXAP10在膀胱癌及前列腺癌肿瘤组织中表达高于癌旁正常组织，在膀胱癌细胞、胰腺癌细胞中表达高于正常上皮细胞，DUXAP10表达水平越高，肿瘤分期越晚，预后越差[4, 6, 9]。本研究结果进一步显示，上调DUXAP10表达后，甲状腺癌细胞增殖受到促进，凋亡受到抑制，细胞周期活跃。这表明在甲状腺癌细胞中DUXAP10促进了甲状腺癌进展，是促癌基因。一项关于胃癌细胞中的研究显示，下调DUXAP10表达可抑制胃癌细胞增殖，诱导胃癌细胞停留在G1期比例升高[10]。在结直肠癌细胞中，DUXAP10促进结直肠癌进展[11]。

Akt/mTOR信号通路是多种恶性肿瘤细胞增殖及凋亡的重要调控通路[12]。本研究结果显示，上调甲状腺癌细胞DUXAP10表达后，p-Akt/Akt及p-mTOR/mTOR比例升高，这表明，DUXAP10可能通过调控Akt/mTOR信号通路介导甲状腺癌细胞增殖及凋亡。本研究结果显示，Akt/mTOR信号通路与甲状腺癌的发生、发展具有密切关系，并与甲状腺癌细胞靶向药物耐药相关[13-14]，Akt/mTOR通路阻断剂对甲状腺癌可能具有治疗作用[15]。在肝癌细胞中，DUXAP10通过PI3K/Akt/mTOR通路调控肝癌细胞增殖及凋亡[16]。

综上所述，DUXAP10可能通过靶向激活Akt/mTOR信号通路促进甲状腺癌细胞增殖，抑制凋亡，DUXAP10可能作为甲状腺癌诊断的标志物及治疗的靶基因，但须进一步实验探讨。