抵挡丸加味鸡血藤通过PI3K/AKT信号通路抑制结直肠癌上皮间充质转化

薛雾松，刘仍海

结直肠癌(colorectal cancer， CRC)是成人最常见的恶性肿瘤之一，在全球癌症相关死亡主要原因中排名第三位[1]。约1/3的CRC患者确诊时已处于进展期，失去了最佳手术时机[2]。肝转移是导致CRC患者死亡的最主要因素[3-4]。因此探索CRC发展和肝转移的分子机制，将有助于发现用于开发早期诊断和有效治疗靶点的生物标志物[5]。

现代中医理论认为，湿热邪毒是肿瘤发生、发展的重要原因之一。结肠癌的发生是由于机体正气不足，脾失健运，气机不畅，邪毒侵入，湿热蕴结，局部气血运行不畅，湿毒瘀凝下注于肠，滞留积聚所致。《伤寒论》中记载，抵挡丸加味鸡血藤可起到“祛瘀通络，活血攻毒”的疗效。已有研究表明，鱼藤酮能够显著抑制CRC细胞在裸鼠体内的生长，其通过阻断PI3K/AKT信号通路活性抑制Lovo和SW480结肠癌细胞在体内外的增殖和转移能力，诱导其凋亡[6]。抵挡丸加味鸡血藤提取物中含有鱼藤酮，本研究拟探讨抵挡丸加味鸡血藤对CRC发病和转移的疗效和机制，为其治疗提供新的分子靶点；深化中医药预防和治疗CRC发病及肝转移的机制，为临床治疗提供新药和指导法则。

1 材料与方法

1.1实验动物和细胞 ①实验动物：7～8周龄SPF级雌性裸鼠18只(北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物许可证号：JDF-IRB-2020003801)。小鼠饲养环境温度为(22±2)℃，湿度55%±15%，12 h明暗光照循环。小鼠自由进食。②实验细胞：SW620细胞购自ATCC，培养条件为加有10%胎牛血清(FBS)的Leibovitz's L-15培养基，37℃、5% CO2培养箱中传代培养。

1.2实验材料 FBS和Leibovitz's L-15培养基购自Gibco公司；CCK8检测试剂盒、凋亡检测试剂盒、RIPA裂解缓冲液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量检测试剂盒、原位缺口末端标记法(TUNEL)凋亡试剂盒，均购自Beyotime Biotechnology；抗E-cadherin、N-cadherin、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT购自CST。抵挡丸加味鸡血藤为“抵挡丸”(水蛭9 g，虻虫9 g，桃仁6 g，大黄15 g)加味鸡血藤9 g制成。

1.3CCK8细胞增殖检测 将SW620细胞(上海奥陆生物科技)以每孔2×103个，接种到96孔板中，分别培养1、2、3和4 d。然后，向每个孔中加入10 μl的CCK8溶液，并通过酶标仪测量450 nm处的吸光度。

1.4免疫蛋白印迹 CRC细胞系SW620经抵挡丸加味鸡血藤和PI3K抑制剂LY294002处理48 h后，收集细胞，裂解后经免疫蛋白印迹法检测p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、E-cadherin和N-cadherin表达情况。具体操作步骤如下：使用RIPA裂解缓冲液分离SW620细胞的蛋白质，使用BCA蛋白测定试剂盒测量蛋白质的浓度。蛋白质在10%十二烷基硫酸钠-丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上分离，并转移到PVDF膜上，用5%脱脂牛奶封闭膜1.5 h。然后用抗E-cadherin、N-cadherin、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT孵育PVDF膜。洗涤3次后，将膜与辣根过氧化物酶-酶耦联的二抗体孵育。使用iBright成像系统对条带进行可视化和定量。β-肌动蛋白作为内部对照。E-Cadherin和N-Cadherin在提取蛋白后需超声处理。

1.5Annexin-V/PI细胞凋亡检测 凋亡检测试剂盒测定凋亡细胞。将细胞以300×g离心5 min，并用预冷磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次，添加结合缓冲液195 μl到细胞中，随后加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl的PI在25℃下避光孵育20 min。通过流式细胞术测定细胞凋亡比例。

1.6免疫荧光染色 免疫荧光检测SW620细胞E-cadherin、N-cadherin表达情况。细胞经过抵挡丸加味鸡血藤组(1000 μg/ml)和LY294002组(500 nmol/L)处理48 h以后，加入4%多聚甲醛固定30 min，用PBS洗涤2次后，E-cadherin、N-cadherin抗体于4℃孵育过夜，次日经PBS洗涤3次后，加入FITC标记的二抗于室温孵育1 h，PBS洗涤3次后封片，经荧光显微镜拍照。每片随机选取3个视野经IPP统计荧光强度。

1.7CRC荷瘤小鼠及分组 每只裸鼠背部接种SW620细胞2×106个，待肿瘤体积达约50 mm3时，随机分为对照组、抵挡丸加味鸡血藤组和LY294002组，每组6只。对照组给予生理盐水灌胃;抵挡丸加味鸡血藤组给予抵挡丸加味鸡血藤100 mg/kg灌胃；LY294002组给药剂量为10 mg/kg(药物含量/小鼠体重)，每周3次，持续2周。肿瘤体积计算方式为：肿瘤体积=1/2×a(长径)×b2(短径)。

1.8肿瘤组织中的细胞凋亡检测 TUNEL凋亡检测试剂盒用于检测肿瘤组织中的细胞凋亡情况。肿瘤组织经冷冻切片，片厚8 μm，经4%多聚甲醛固定30 min，用PBS洗涤2次，然后按说明书染色孵育显色，最后拍照。每只小鼠肿瘤组织切片随机选取3个视野，统计TUNEL标记阳性细胞数量。

2 结果

2.1抵挡丸加味鸡血藤对细胞增殖和凋亡的影响

2.1.1细胞增殖情况比较：与对照组比较，CRC细胞系SW620经抵挡丸加味鸡血藤和PI3K抑制剂LY294002处理后，细胞生长速率减缓。培养第4天，抵挡丸加味鸡血藤组与LY294002组SW620细胞增殖速率显著性低于对照组(P<0.05)；但抵挡丸加味鸡血藤组与LY294002组SW620细胞生长速率比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

图1 3组SW620细胞增殖的抑制作用比较与对照组比较，aP<0.05

2.1.2细胞凋亡情况比较：与对照组比较，抵挡丸加味鸡血藤组及LY294002组处理48 h后CRC细胞系SW620细胞凋亡比例显著性升高(P<0.05)；抵挡丸加味鸡血藤组与LY294002组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图2、3。

图2 流式细胞仪检测3组SW620细胞的凋亡情况

图3 3组SW620细胞的凋亡情况比较与对照组比较，aP<0.05

2.2抵挡丸加味鸡血藤对PI3K/Akt信号通路的影响 与对照组比较，抵挡丸加味鸡血藤组和LY294002组p-PI3K/PI3K、p-Akt/Ak比值显著降低(P<0.05)，但抵挡丸加味鸡血藤组与LY294002组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图4、5。

图4 3组SW620细胞PI3K/Akt信号通路免疫蛋白印迹图

2.3抵挡丸加味鸡血藤对SW620细胞侵袭/迁移相关蛋白表达的影响 与对照组比较，抵挡丸加味鸡血藤组和LY294002组N-cadherin表达水平显著降低，E-cadherin表达水平显著升高(P<0.05)。抵挡丸加味鸡血藤组与LY294002组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图6、7。与对照组比较，抵挡丸加味鸡血藤组与LY29400组N-cadherin荧光显著降低，E-cadherin荧光显著升高(P<0.05)；但抵挡丸加味鸡血藤组与LY294002组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图8、9。

图5 抵挡丸加味鸡血藤抑制PI3K/Akt信号通路的影响与对照组比较，aP<0.05

图6 3组SW620细胞N-cadherin和E-cadherin免疫蛋白印迹图

图7 3组SW620细胞N-cadherin和E-cadherin表达比较与对照组比较，aP<0.05

图8 3组SW620细胞N-cadherin和E-cadherin免疫荧光染色结果(×20)蓝色荧光标记为细胞核；绿色荧光标记为N-cadherin/E-cadherin

图9 3组SW620细胞N-cadherin和E-cadherin相对荧光强度比较与对照组比较，aP<0.05

2.4抵挡丸加味鸡血藤对SW620荷瘤小鼠肿瘤的抑制作用 SW620荷瘤小鼠经抵挡丸加味鸡血藤和PI3K抑制剂LY294002治疗后，肿瘤生长速度明显降低。实验终点时，与对照组比较，抵挡丸加味鸡血藤组和LY294002组小鼠肿瘤体积显著性缩小(P<0.05);但抵挡丸加味鸡血藤组与LY294002组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图10。随后，取材经TUNEL染色检测肿瘤内细胞凋亡情况，实验结果显示，与对照组比较，抵挡丸加味鸡血藤组和LY294002组肿瘤内凋亡细胞数量显著性升高(P<0.05)，但抵挡丸加味鸡血藤组与LY294002组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图11、12。

图10 3组SW620荷瘤小鼠肿瘤体积比较与对照组比较，aP<0.05

图11 3组SW620荷瘤小鼠肿瘤TUNEL染色结果比较(标尺长度50 μm)

图12 3组SW620荷瘤小鼠肿瘤LUNEL涂色后细胞凋亡比较与对照组比较，aP<0.05

3 讨论

据统计2018年全球CRC有超过180万新诊断病例和88.1万死亡病例，约占全部癌症病例和死亡人数的1/10，而肝转移是导致CRC患者死亡的最主要因素[1,7-8]。PI3K/AKT信号通路是肿瘤中激活最频繁的信号通路之一，该信号通路活化是癌症的标志[9-11]。人类细胞中有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三类PI3K表达，Ⅰ类PI3K的脂质产物可激活下游激酶AKT(AKT1、AKT2、AKT3)。实体癌症中常见PI3K信号通路的激活突变，该突变率在晚期乳腺癌、胃癌和CRC等不同肿瘤类型中增加了30%～60%[12-13]。已有研究表明，PI3K/Akt信号通路异常激活与上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)密切相关。EMT是肿瘤最常见的侵袭和转移起始原因[14-16]。E-cadherin、N-cadherin是与EMT密切相关的钙黏蛋白。在肺癌中WSTF可激活PI3K/Akt信号通路，下调E-cadherin，上调N-cadherin的表达，肿瘤细胞呈现典型的EMT形态学变化[17]。CRC中也发现类似的结果，Gli1通过PI3K-Akt信号通路激活EMT，促进CRC细胞转移[18]。因此，抑制PI3K/Akt信号通路的异常激活或可抑制肿瘤的增殖和迁移。

湿热邪毒是肿瘤发生、发展的重要原因之一。《医宗金鉴》云“痈疽原是火毒生，经络阻塞气血凝”，因邪热侵袭、导致气滞血瘀、肿块形成。CRC的发生也正是由于机体正气不足，脾失健运，气机不畅，邪毒侵入，湿热蕴结，局部气血运行不畅，湿毒瘀凝下注于肠，滞留积聚所致。其证候特征为局部肿块，或肿瘤破溃，灼热疼痛，脓血腥臭，发热，心烦，口渴，尿赤便秘，舌红苔黄、脉数。“祛瘀通络，活血攻毒”法是指由“抵挡丸”出自《伤寒论》：水蛭9 g，虻虫9 g，桃仁6 g，大黄15 g加味鸡血藤9 g治之。水蛭，功效破血，逐瘀；虻虫，逐瘀消症；桃仁，活血祛瘀；大黄，凉血解毒，泻热逐瘀；鸡血藤，功效补血、活血、通络。本实验体外研究结果表明，抵挡丸加味鸡血藤可通过抑制PI3K/Akt信号通路，抑制肿瘤细胞增殖和促进细胞凋亡，同时上调E-cadherin，下调N-cadherin的表达，抑制肿瘤细胞EMT形态学转变。本实验体内研究结果进一步证明，抵挡丸加味鸡血藤可显著抑制CRC荷瘤小鼠肿瘤细胞的增殖，促进肿瘤组织内细胞的凋亡。

综上所述，在CRC细胞系SW620中，抵挡丸加味鸡血藤具有显著的抗肿瘤效果，其通过抑制PI3K/Akt信号通路的异常激活，抑制肿瘤的增殖，并促进细胞的凋亡。调节EMT相关蛋白E-cadherin/N-cadherin表达，抑制肿瘤的EMT进程，发挥抗肿瘤效果。本研究通过“祛瘀通络，活血攻毒”法的干预，揭示了CRC发病和肝转移机制；为CRC治疗提供了新的分子靶点，深化中医药预防和治疗CRC发病及肝转移的机制，为临床治疗该病提供了新药和指导法则。