百合固金汤治疗非小细胞肺癌的作用机制研究

周 洁，刘志光，谭建龙，侯旭阳，贺 君，吴趋荟

（1.湖南师范大学附属第一医院，长沙 410000；2.中南大学湘雅二医院，长沙 410000；3.湖南中医药大学第一附属医院，长沙 410000）

肺癌是全球最常见的癌症，在2018 年新诊断癌症病例中占比11.6%，在因癌症死亡的病例中占比18.4%［1］。在我国，肺癌也是最常见的恶性肿瘤，其发病率、致死率均居首位，5 年生存率仅为19.7%［2］。非小细胞癌（Non-small cell lung cancer，NSCLC）是最常见的肺癌病例类型，约占肺癌总病例的85%［3］，多数NSCLC 诊断时已处晚期［4］。由于诊断时多处于晚期、对化疗药物易耐受、快速转移和易复发等特性导致治疗方案选择有限和患者生存期较短［5，6］。百合固金汤（BHGJT）出自《慎斋遗书》，全方由百合、生地、熟地、当归、玄参、白芍、桔梗、麦冬、贝母、甘草组成。BHGJT善补气阴而平虚火，治肺肾阴虚，可使肺金宁、肺气顺，契合了中医治疗肺癌“攻邪不伤正”、“治病求本”的治疗大法。但其治疗NSCLC 的现有现代分子理论基础薄弱，因而深入探讨BHGJT 在NSCLC 中的杀伤机制具有重要的临床意义。

1 资料与方法

1.1 动物 雄性无胸腺裸鼠20 只，6 周龄，SPF 级，小鼠体重约为18g，购买于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，保持室温25℃和空相对湿度恒定60%，12h 明暗循环，每天以标准饲料饲养。本实验通过中南大学湘雅二医院动物伦理委员会批准。

1.2 细胞 选用NSCLC 细胞株A549 和H1299，购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。A549 细胞在添加1%青霉素链霉素和10%胎牛血清的F12 培养基中培养，H1299 细胞在添加1%青霉素链霉素和10%胎牛血清的RPMIR-1640 培养基中培养。所有细胞置于37℃下5%二氧化碳的加湿培养基中。

1.3 药物 BHGJT 方剂由10 种临床中经常使用的中草药组成（生地、熟地、当归各9 克，白芍、甘草各3 克，麦冬、贝母、百合各1.5 克，玄参、桔梗各2.4 克）。根据中国古籍《慎斋遗书》确定了本研究的剂量。制备BHGJT 的原料药来自湖南省中医药大学第一附属医院。将BHGJT 生药置于70%乙醇浸泡30 分钟，采用回流法提取成分，过滤两次。将过滤液体通过真空旋转蒸发仪，干燥成粉末。将BHGJT 粉末用0.9%的生理盐水稀释至0.5g/mL。制备小份BHGJT 溶液，并在-20℃下储存，直至使用。

1.4 试剂 4%多聚甲醛（新赛美生物科技有限公司）；CCK-8 试剂盒，牛血清白蛋白，RIPA 缓冲液，流式周期试剂盒、结晶紫染色液（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）；DAB 染色液，苏木素精（珠海贝索生物技术有限公司）；EdU 检测试剂盒，流式凋亡试剂盒（上杭州联科生物技术股份有限公司）；Bax 抗体，Bad 抗体，Ki67抗体，Bcl-2 抗体，GAPDH 抗体（武汉爱博泰克生物科技有限公司）；Cleaved caspase9 抗体（安诺伦（北京）生物科技有限公司）；Cleaved caspase3 抗体（美国CST 公司）

1.5 仪器 微板分光光度计（美国Thermo Fisher 公司）；增强化学发光系统（美国Life Tec 公司）；荧光显微镜观察细胞（美国Olympus Inc 公司）；BD FACSARIA II流式细胞仪（美国Becton Dickinson 公司）；Prism 软件（GraphPad Prism 6）；ImageJ 软件（版本11）。

1.6 方法

1.6.1 细胞活性/增殖实验 用CCK-8 试剂盒检测细胞活性/增殖率。将细胞置于96 孔板中，每组至少3个重复，分别加入不同剂量的BHGJT，在37℃下培养24h。将CCK-8 试剂添加到每个孔中并培养3 小时，然后使用微板分光光度计测定上样孔在450 nm 处的OD值。所有数值均与未添加细胞的对照组标准化，并以平均值±标准差表示。

1.6.2 克隆形成实验 通过稀释梯度稀释NSCLC 细胞，然后在6 孔板中每孔接种5x103个NSCLC 细胞，按0.5mg/mL 加入BHGJT。细胞培养7d，PBS 洗涤2 次，4%多聚甲醛固定，1%结晶紫染色液染色。

1.6.3 皮下移植瘤模型 将3x106个A549 细胞注射到裸鼠右背侧（n=5）。设置对照组和处理组，处理组中的裸鼠每天按500mg/kg 灌胃BHGJT。

1.6.4 蛋白质印迹实验 将处理过的NSCLC 细胞在添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA 缓冲液中裂解，并在冰上孵育30 分钟。丢弃沉淀后收集上清液。在变性的蛋白质中加入上样缓冲液，然后加到SDS-PAGE的腔室中，然后电转移到PVDF 上。用5%BSA 封闭1h后，用稀释后的一级抗体在4℃孵育过夜。第二天，用TBST 漂洗PVDF 膜3 次，每次10min，然后用1：2000稀释的二抗体在室温下孵育1h。免疫复合物通过增强化学发光系统进行检测。使用ImageJ 软件对条带进行分析和量化。

1.6.5 免疫组化染色 从石蜡包埋样品中制备4μM 厚的切片，然后依次去石蜡化，然后在黑暗中用3%H2O2孵育15 分钟，用枸橼酸钠缓冲液（10 mM 柠檬酸钠和0.05%Tween 20，pH 6.0）在96°C 下进行酶原修复，PBS洗涤3 次后，用ki67 和caspase-3 抗体孵育2h，以兔对照IgG 为对照，而后二抗孵育。进行DAB 染色，后用苏木精染核。然后将切片置于返蓝液中返蓝，二甲苯中浸泡脱水处理，并用中性树脂固定。

1.6.6 Ed U 实验 细胞接种于24 孔板中培养24h，第二天用PBS 冲洗一次，37 ℃下用Ed U 培养2h，再用PBS 冲洗3 次。在用0.25%Triton X-100 渗透后，用DAPI 染核，而后封片。使用荧光倒置显微镜观察细胞。

1.6.7 流式细胞术 流式细胞术检测细胞周期和凋亡率。取各组细胞，使用DPBS 重悬清洗细胞3 次，而后于1×结合缓冲液中复悬浮，37℃下用annexinv和PI 溶液染色30min。接下来，这些细胞被送到BD FACSARIA II 流式细胞仪进行检测。PI 周期检测试剂盒按照制造商的指南使用。染色后，送到BD FACSARIA II 流式细胞仪进行检测。

1.6.8 统计分析 所有统计分析均使用Prism 软件进行。采用双尾Student t 检验评估两组之间的显著差异。对于三组甚至更多的组别，采用单因素方差分析。P 值的阈值为0.05，当P 值小于0.05，则认为组间具有统计学意义。

2 结果

2.1 BHGJT 体外抑制NSCLC 的增殖和克隆形成 为了验证BHGJT 在体外对NSCLC 的抑制作用，我们进行了CCK-8、EdU 和克隆形成实验。在给药组中，随着BHGJT 的给药浓度增加，NSCLC 细胞的活性逐渐降低（图1A）。此外，EdU 分析证实，在0.5mg/mL BHGJT 处理后，NSCLC 细胞A549 和H1299 的增殖活性明显减弱（图1B 和C）（P＜0.01）。接下来，我们进行了克隆形成实验。NSCLC 细胞A549 和H1299 在BHGJT 治疗后，克隆形成的能力明显降低（图1D）（P＜0.01）。因此，这些数据表明BHGJT 能在体外显著抑制NSCLC 的活性和克隆形成，抑制NSCLC 细胞的增殖。

图1 A：用CCK-8法检测A549和H1299的细胞活性；B和C：EdU实验检测A549和H1299的细胞增殖能力；D：用克隆形成实验测定细胞克隆能力。*P＜0.05，**P＜0.01。

2.2 BHGJT 体内杀伤NSCLC 为了在体内进一步验证BHGJT 对NSCLC 的作用，我们将A549 细胞用基质胶重悬后，皮下注射到裸鼠背部皮下。每日给实验组裸鼠按500mg/kg BHGJT 灌胃，对照组以生理盐水灌胃。与对照组相比，实验组的肿瘤体积明显减小（图2A 和B）（P＜0.05）。四周后，我们将裸鼠的皮下移植瘤取下，进行石蜡包埋切片，然后做免疫组化染色，发现实验组中肿瘤组织的Ki67 表达明显降低，而Cleaved caspase 3的表达显著增高。Ki67 是一种常用来标记细胞增殖能力的指标，而caspase 3 是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，剪切体caspase 3 高表达提示BHGJT 在体内诱发显著的凋亡。这些结果说明，BHGJT 在体内是通过诱导肿瘤细胞发生凋亡来抑制NSCLC 细胞的生长，从而发挥治疗NSCLC 的作用。

2.3 BHGJT 通过诱导NSCLC 细胞周期G0G1 阻滞和凋亡治疗NSCLC 我们的结果初步证实BHGJT 对NSCLC 具有确切的杀伤效果，但其杀伤肿瘤细胞的生物学机制尚不清楚。我们先用PI 染色细胞，然后用流式细胞仪分析BHGJT 治疗前后的细胞周期分布。在两种细胞系的治疗组中观察到G0G1 期所占比例明显增加（图3A 和B）。在A549 细胞中，对照组和治疗组的G0G1 期分别为55.3%和64.7%；在H1299 细胞中，对照组和治疗组的G0G1 期分别为52.5%和70.1%。因此，BHGJT 处理后NSCLC 细胞发生了明显的G0G1 期阻滞，进而抑制了细胞增殖。进一步，我们通过流式细胞术测定细胞凋亡比例，发现处理组肿瘤细胞发生了明显的凋亡（图3C）。在A549 细胞中，对照组和治疗组（2.0mg/ml BHGJT）的凋亡比例分别为3.19%和54.2%；在H1299 细胞中，对照组和治疗组（2.0mg/ml BHGJT）的凋亡比例分别为3.63%和44.65%。在不同浓度的BHGJT 作用下，促凋亡相关蛋白Bad、Bax、Cleaved caspase 9 和Cleaved caspase 3 呈浓度依赖性表达增高，而抑凋亡相关蛋白Bcl-2 呈浓度依赖性表达降低（图3D）。因此，这些数据表明BHGJT 是通过诱导NSCLC细胞的G0G1 周期阻滞和凋亡来发挥治疗NSCLC 的作用。

图二 A：将A549细胞皮下注射于裸鼠体内；B：移植瘤的体积；C和D：Ki67和剪切体caspase-3的IHC染色。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

图三 A和B：流式细胞仪检测A549和H1299细胞周期的变化；C：流式细胞仪检测A549和H1299细胞凋亡率的变化；D：通过蛋白印迹实验检测A549和H1299细胞中Bad、Bax、Bcl-2、Cleaved caspase 9、Cleaved caspase 3的蛋白表达变化。

3 讨论

目前，中医药在治疗包括癌症在内的多种疾病的前景已引起全球的关注。许多中草药的生物活性成分显示出强大的抗癌能力且毒副作用也较小［7，8］。BHGJT 是目前治疗肺癌较为常用且疗效显著的方剂之一［9，10］。临床上年迈体虚及中晚期NSCLC 患者多数正气已虚，癌瘤内生及放化疗药物长期使用使阴液暗耗，久病及肾，肾水不足则虚火邢金，加之久咳肺阴必伤，进一步耗伤肺阴，故常表现为气阴两虚及肺肾两虚的表现，BHGJT 善补气阴而平虚火，主治肺肾阴虚，可使肺金宁、肺气顺。我们的研究发现BHGJT 可显著降低NSCLC 细胞活性、抑制增殖、干扰体外克隆形成、抑制肿瘤的体内生长并诱导显著凋亡，具有确切的抗癌作用。

现代药理学研究提示多种BHGJT 成分具有确切的抗癌作用。如在黑色素瘤和Lewis 肺癌裸鼠移植瘤中百合纯多糖有较强的治疗作用［11］。熟地黄水体液裸鼠灌胃，发现其分泌的细胞因子TNF-α明显增加，表明熟地黄水具有一定的抗肿瘤作用［12］。当归中的当归多糖可抑制肺癌细胞共培养微环境中骨髓间充质干细胞的异常增殖及降低肿瘤相关成纤维细胞相关分子的表达［13］。这些证据表明BHGJT 中有多种成分具有抗肿瘤作用，这与我们的研究结论是相符的。在此基础上，探索BHGJT 中起主要的成分，寻找靶向清晰的抗瘤成分将对临床上治疗肺癌起着至关重要的作用。

中药治疗肿瘤的机制大多集中在抑制细胞增殖、诱导凋亡和自噬。比如，泽漆汤通过p53 途径诱导NSCLC 细胞凋亡和G0G1 期阻滞［14］；双氢青蒿素可以上调死亡受体5 的表达并与TRAIL 协同诱导人前列腺癌细胞发生凋亡［15］；华蟾毒精可能通过DR 介导的外源性通路，引起肝癌细胞发生凋亡［16］。自噬性死亡也是中药杀伤肿瘤的重要方式。传统中药如雷公藤、穿心莲富含的山奈酚可活化IRE1-JNK-CHOP 信号通路，并抑制G9a 介导的表观遗传学改变，诱导自噬性死亡，从而抑制胃癌细胞生长［17］。通过流式细胞术分析，在BHGJT 治疗后，NSCLC 细胞发生明显的凋亡和周期阻滞。肿瘤促凋亡相关蛋白Bad、Bax、Cleaved caspase 9和Cleaved caspase 3 在治疗后表达也明显增加［18，19］，而抑凋亡相关蛋白Bcl-2 则减少［20］，这都提示BHGJT 能有诱导肿瘤发生凋亡，从而起到抗癌作用。

总之，我们从细胞和动物两个层面证实了BHGJT能抑制NSCLC 细胞活性和增殖，干扰体外克隆形成并显著降低肿瘤的体内生长。而且我们进一步揭示了BHGJT 通过诱导周期阻滞和凋亡的方式杀伤NSCLC。本研究利用体外和在体实验证实了BHGJT 对NSCLC的治疗作用，验证了其作用的生物学机制，为研究其更深层次的分子机制打下基础，为推动BHGJT 这一经典方剂治疗肺癌提供理论支持。