血小板膜糖蛋白特异性抗体在儿童免疫性血小板减少症中的 表达及临床意义

张 晴，高长俊，李 旭，任 蓉，韩 静

（唐山市妇幼保健院 小儿血液科，唐山 063000）

儿童免疫性血小板减少症是儿童最为常见的出血性疾病之一，主要表现为血小板的异常，皮肤和粘膜发生自发性出血［1］。多项研究发现［2-3］，与正常成人相比，儿童免疫性血小板减少症的实验室检查存在显著差异，绝大多数儿童免疫性血小板减少症均有一定的自限性，且预后较好。目前研究认为儿童免疫性血小板减少症的发病机制主要为机体T 细胞的异常性增生以及巨核细胞的分化成熟不良。血小板膜糖蛋白特异性抗体对于临床鉴别免疫性与非免疫性血小板减少症具有重要意义，其主要包括GP Ⅱb/Ⅲa 以及GP Ⅰb/Ⅸ，主要通过对Fc-途径进行血小板的清除作用，同时也可通过对网状内皮系统的诱导作用的显著激活，进而影响其血小板的活化以及凋亡，进一步加剧儿童免疫性血小板减少症的产生［4］。本研究主要通过血小板膜糖蛋白特异性抗体在儿童免疫性血小板减少症中的表达及临床意义分析，为临床诊断以及预后判定提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本研究为横断面调查，选择2018 年3月～2019 年10 月在本院就诊的儿童免疫性血小板减少症患儿120 例作为研究对象，其中，男性患儿69 例，女性患儿51 例，平均年龄（3.82±1.11）岁，病程平均为（8.22±2.54）月，平均血小板计数为（32.11±13.22）109，另选取同期健康体检的健康患儿120 例作为对照组，两组患儿的性别、年龄、体重指数之间的差异不存在统计学意义（P＞0.05），详见表1。所有患儿均签署知情告知书，并经伦理委员会论证并批准。

患儿入选标准：①所有患儿均符合儿童免疫性血小板减少症诊断标准［5］；②两次血常规检测，患儿的血小板计数早100*109以下，患儿的红细胞形态未见异常；③皮肤出血、瘀斑以及脏器出血。排除标准：①其他继发性的血小板减少征；②免疫系统疾病；③造血系统疾病；④严重器质性功能障碍患儿。

表1 两组基线资料比较

1.2 研究方法 血小板膜糖蛋白特异性抗体检测：所有研究对象入组后，采集患儿的静脉血4mL 后，使用EDTA 进行抗凝处理，3500r/min 离心15min。分离血浆至于-80℃冰箱进行保存。取正常人体O 型血小板，调整其密度为109/L 的悬浮液，在EP 管中加入以上研究对象的血浆以及血小板悬浮液各100μL，混匀后，在室温条件下进行孵育，孵育时间设定为60min。同时使用PBS 液对上述孵育后的混合液体进行冲洗3 次，冲洗结束后，EP 管中加入血小板裂解液100μL，混匀后在4℃的冰箱中进行孵育30min，再次，3500r/min 离心30min，将获得的上清液按照1：5 的比例进行稀释，以上样本100μL 加入俘获当单抗羊抗鼠抗体的酶标板上，在室温条件下进行震荡孵育60min，同时再次使用PBS 液对上述孵育后的混合液体进行冲洗4 次，每孔中再次加入100μL 的碱性磷酸酶标记的羊抗人抗体，密封后再次在室温条件下震荡60min，采用PBS 液对上述孵育后的混合液体进行冲洗6，随后加入100μL 的底物缓冲液，在37℃下进行孵育3 小时，使用酶标仪分别对GP Ⅱb/Ⅲa 以及GP Ⅰb/Ⅸ抗体的吸光度值进行测量。

1.3 观察指标

1.3.1 两组GP Ⅱb/Ⅲa 以及GP Ⅰb/Ⅸ抗体水平之间的差异 分别对观察组以及对照组的GP Ⅱb/Ⅲa以及GP Ⅰb/Ⅸ抗体水平进行比较。

1.3.2 不同出血程度患儿的GP Ⅱb/Ⅲa 以及GP Ⅰb/Ⅸ抗体水平比较 按照出血分级标准，分别对0、1、2 级患儿的GP Ⅱb/Ⅲa 以及GP Ⅰb/Ⅸ抗体水平进行比较。

1.3.3 不同预后患儿的GP Ⅱb/Ⅲa 以及GP Ⅰb/Ⅸ抗体水平之间的差异 分别对三个月内缓解患儿以及未缓解患儿的GP Ⅱb/Ⅲa 以及GP Ⅰb/Ⅸ抗体水平进行比较。患儿的缓解主要表现为治疗后患儿的血小板计数在30*109以上，相比治疗前，其血小板的提升幅度在2 倍以上，患儿的出血症状显著下降。

1.3.4 GP Ⅱb/Ⅲa 以及GP Ⅰb/Ⅸ联合诊断对儿童免疫性血小板减少症诊断效能分析 采用ROC 曲线对GP Ⅱb/Ⅲa 以及GP Ⅰb/Ⅸ联合诊断效能进行分析。

1.4 统计学方法 文中数据均采用SPSS 20.0 软件进行汇总分析。计量资料以mean±SD 表示，比较采用独立样本t 检验，计数资料以［n（%）］表示，采用卡方检验，联合检测效能分析采用ROC 曲线，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组GP Ⅱb/Ⅲa 以及GP Ⅰb/Ⅸ抗体水平比较 观察组患儿的GP Ⅱb/Ⅲa 以及GP Ⅰb/Ⅸ抗体水平显著高于对照组（t=107.778，69.879，P＜0.05），详见表2。

表2 两组GPⅡb/Ⅲa以及GPⅠb/Ⅸ抗体水平比较

2.2 不同出血程度患儿的GP Ⅱb/Ⅲa 以及GP Ⅰb/Ⅸ抗体水平比较 不同出血程度患儿的GP Ⅱb/Ⅲa 以及GP Ⅰb/Ⅸ抗体水平之间的差异存在统计学意义（P＜0.05），随着患儿的出血程度的加重，患儿的GP Ⅱb/Ⅲa 以及GP Ⅰb/Ⅸ抗体水平显著提升（P＜0.05），详见表3。

2.3 不同预后患儿的GP Ⅱb/Ⅲa 以及GP Ⅰb/Ⅸ抗体水平之间的差异 缓解组患儿的GP Ⅱb/Ⅲa 以及GP Ⅰb/Ⅸ抗体显著低于未缓解组（t=17.262，18.159，P＜0.05），详见表4。

2.4 GP Ⅱb/Ⅲa 以及GP Ⅰb/Ⅸ联合诊断对儿童免疫性血小板减少症诊断效能分析 在对儿童免疫性血小板减少症诊断中，GP Ⅱb/Ⅲa 以及GP Ⅰb/Ⅸ的联合诊断灵敏度显著高于单独检测，通过ROC 曲线分析（图1），在对儿童免疫性血小板减少症诊断中，GP Ⅱb/Ⅲa 以及GP Ⅰb/Ⅸ的临界值分别为0.47，0.55，详见表5。

表3 不同出血程度患儿的GPⅡb/Ⅲa以及GPⅠb/Ⅸ抗体水平比较

表4 不同预后患儿的GPⅡb/Ⅲa以及GPⅠb/Ⅸ抗体水平之间的差异

表5 GPⅡb/Ⅲa以及GPⅠb/Ⅸ联合诊断对儿童免疫性血小板减少症诊断效能分析

3 讨论

儿童免疫性血小板减少症的发病较为复杂［6］，目前认为，血小板的GP Ⅱb/Ⅲa 以及GP Ⅰb/Ⅸ抗体水平是疾病进展的重要原因［7］。血小板膜糖蛋白特异性抗体通过对血小板抗原特异性结合，进一步破坏机体的血小板，降低机体的血小板数量，机体的凝血功能显著障碍，最终导致出现临床出血症状。

在本研究中，通过与健康人群比较，儿童免疫性血小板减少症患儿的GP Ⅱb/Ⅲa 以及GP Ⅰb/Ⅸ抗体水平显著升高，在临床试验中发现，GP Ⅱb/Ⅲa 主要通过对FC 途径对患儿的血小板进行清除，而GP Ⅰb/Ⅸ抗体水平则不通过FC 途径对患儿的血小板进行清除，其主要通过对机体的网状内皮系统的激活，进而引发患儿的血小板的聚集以及凋亡［8］。在疾病进展过程中，随着患儿的疾病进展，其血小板计数显著下降，出血程度显著提升［9］，有研究指出［10］，在机体的血清中，GP Ⅱb/Ⅲa 以及GP Ⅰb/Ⅸ不仅可直接通过对患儿的血小板作用，同时，GP Ⅱb/Ⅲa 以及GP Ⅰb/Ⅸ与机体的血小板抗原的结合，进而形成复合物，影响患儿的血液纤维程度，参与血小板的黏附以及聚集［11］。GP Ⅰb/Ⅸ作为血小板的血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）的重要受体，进而有效降低患儿的血小板黏附作用［12］。而本研究中，通过对患儿的GP Ⅱb/Ⅲa 以及GP Ⅰb/Ⅸ与疾病进展程度的分析，随着患儿的GP Ⅱb/Ⅲa 以及GP Ⅰb/Ⅸ显著性升高，患儿的出血倾向呈现显著升高趋势。张颖等［13］通过对免疫性血小板减少症的疾病进展与血小板膜糖蛋白特异性抗体的相关性分析，患儿的治疗效果与血小板膜糖蛋白特异性抗体呈现负相关，与本研究相互印证。

另外通过对患儿的预后进行分析，随着患儿的血小板膜糖蛋白特异性抗体的显著性下降，患儿的临床出血症状显著性下降。分析认为，随着血小板膜糖蛋白特异性抗体水平的下降，其血液的纤溶系统以及血小板计数显著改善［14］，患儿的临床出血倾向显著降低。付盼等通过对儿童原发性血小板减少症患儿的预后分析中，血小板计数的峰值水平可作为患儿预后的重要预测因素［15］。但是血小板的峰值的测定需要一定的时间，对于临床检测不够及时，而通过对患儿的血小板膜糖蛋白特异性抗体的诊断，对于临床诊断以及预后判断的及时性均具有积极的意义。本研究通过对患儿的联合诊断效能和进行分析，GP Ⅱb/Ⅲa 以及GP Ⅰb/Ⅸ的联合诊断灵敏度显著高于单独检测，通过ROC 曲线分析，在对儿童免疫性血小板减少症诊断中，GP Ⅱb/Ⅲa 以及GP Ⅰb/Ⅸ的临界值分别为0.47，0.55，此临界值对于患儿的临床诊断具有重要参考。

图1 GPⅡb/Ⅲa以及GPⅠb/Ⅸ联合诊断对儿童免疫性血小板减少症诊断效能分析

但是本研究还存在一定的局限性，由于样本量较小，在对患儿的诊断效能的分析存在一定的局限性，有待在日后的研究中进行。

儿童免疫性血小板减少症的血小板膜糖蛋白特异性抗体显著高于健康者，且随着患儿的疾病进展，患儿血小板膜糖蛋白特异性抗体GP Ⅱb/Ⅲa 以及GP Ⅰb/Ⅸ显著升高，未来可通过对患儿的GP Ⅱb/Ⅲa 以及GP Ⅰb/Ⅸ水平检测，对患儿的治疗效果进行预测。