LncRNA-ATB 对乳腺癌细胞增殖、迁移和凋亡的影响

刘安娜，骆沿极，肖创清

（湖南师范大学附属第二医院/中国人民解放军联勤保障部队第921医院检验科，长沙 410003）

乳腺癌（breast carcinoma，BC）是全球重要公共卫生问题，是女性最常见的恶性肿瘤之一，也是20～59 岁女性恶性肿瘤死亡的主要原因。目前，BC 的发病率仍较高，严重威胁女性身心健康［1］。而BC 的诊断主要依靠传统肿瘤标志物、影像学及病理检查，以手术、放化疗及内分泌治疗为主，近年来分子靶向治疗也逐渐成为热点。我们仍需进一步研究和发现新的特异性指标，提高BC 的早期诊断水平，也需要寻找更好的分子靶点以促进治疗效果的提高，使该病死亡率降低。

长链非编码RNA（lncRNA-activated by TGF-β，lncRNA-ATB）是位于第14 号染色体，长度约80kb 的lncRNA［2］。目前有文献报道lncRNA-ATB 在多种恶性肿瘤中呈高表达，如肝细胞癌、胃癌、结直肠癌等，并且参与调控肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡过程［2-6］。也有研究证明其在BC 中呈异常表达［7］，但目前对lncRNAATB 调控BC 细胞具体功能及机制的研究仍较少。本文通过研究lncRNA-ATB 对BC 细胞体外增殖、迁移、凋亡等生物学过程的影响，探讨lncRNA-ATB 在BC 细胞中的作用，以期为BC 患者的治疗提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 材料 乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231 购自上海中乔新舟生物科技有限公司；RNA 反转录试剂盒、荧光实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）试剂盒购自北京康为世纪公司，lncRNA-ATB 引物及特异干扰siRNA引物由上海生物工程公司合成。胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自美国Gibco 公司；DMEM 培养基、碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）购自美国Sigma 公司；胰酶消化液、双抗（青链霉素）购自碧云天公司；RNA 提取试剂TRIzol、转染试剂Lipofectamine2000 购自美国Invitrogen公司；Transwell 小室购自Corning 公司；Annexin V-APC细胞凋亡检测试剂盒购自江苏凯基生物公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将人乳腺癌MCF-7 和MDAMB-231 细胞培养于10%胎牛血清（FBS）+1%双抗DMEM 培养基中，置于37℃，5% CO2培养箱中培养。

1.2.2 特异干扰RNA 序列合成及细胞转染 应用ATB 特异性siRNA 序列信息如下：si-ATB-1：正义5′-GCACAGAGCAACUCUAUAATT-3′，反义5′-UUAUAGAGUUGCUCUGUGCTT-3′；si-ATB-2：正义5′-GAGCCGCUAAUUAAUUGAUTT-3′，反义5′-AUCAAUUAAUUAGCGCCUCTT-3′；si-ATB-3：正义5′-GCUAAGGAAAGAUCCAAAUTT-3′，反义5′-AUUUGGAUCUUUCCUUAGCTT-3′；阴性对照：正义5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反义5-′ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。利用Lipofectamine2000 将siRNA 转染至MCF-7 和MDAMB-231 细胞，细胞密度为每毫升1×105个，共设5 组：①空白对照组：乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231 细胞组；②阴性对照组：在MCF-7、MDA-MB-231 细胞中转染阴性对照序列；③si-ATB-1：将siRNA-ATB-1 序列转染至MCF-7、MDA-MB-231 细胞中，同样将si-ATB-2和si-ATB-3 转染至MCF-7、MDA-MB-231 细胞中成为第4 组和第5 组，转染48 小时后采用实时荧光定量PCR 检测siRNA 对lncRNA-ATB 的抑制率。

1.2.3 RNA 提取及q RT-PCR 检测 按Trizol 说明书，采用苯酚-氯仿提取法，分别提取上述细胞中总RNA 提取细胞总RNA，分光光度计测定RNA 纯度及浓度，根据反转录试剂盒操作说明进行反转录合成c DNA，以c DNA 作为模板进行PCR 特异性扩增，检测lncRNA-ATB 的基因表达量。LncRNA-ATB 引物序列：正义5′- AGTTTTCTGTTCTGCCGTCT -3′，反义5′- CCTTACATGGCGTTTAGTCCTG -3′；内参β-actin：正义：5′-ACCCTGAAGTACCCCATCGAG-3′，反义：5′- AGCACAGCCTGGATAGCAAC-3′，反应条件：95℃预变性5min，95℃变性15 s，60℃退火30 s，循环40 次，采用2-△△Ct 法计算各组细胞中LncRNA-ATB 表达水平。

1.2.4 细胞克隆形成实验 分别取转染48h 上述5 组细胞，经胰酶消化后再用DMEM 高糖培养基重悬细胞，以每孔200 个细胞的密度接种于6 孔板内，置37°C 、5%CO2及饱和湿度的细胞培养箱中，培养2～3 周，2～3 天换液一次，培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养，弃培养液，PBS 液浸洗2 次，每孔加入4%多聚甲醛固定细胞15min，去固定液，结晶紫染液室温染色30min，流水缓慢洗去染色液，空气干燥，细胞拍照。10%的醋酸浸泡，使脱色，550nm 处，酶标仪测定吸光度（OD）值，重复三次结果。

1.2.5 Transwell 细胞迁移实验 分别取转染48h 上述5 组细胞，经胰酶消化离心后，再用无血清DMEM 培养基重悬细胞至重悬细胞至2×106个细胞/mL，基质胶包被的Transwell 小室上室中每孔接种100μL，下室每孔均加入500μL 10%FBS 完全培养基置37℃培养箱中放置48h 后，吸出上室培养基，用PBS 洗3 遍，棉球擦去上室残余细胞，用4%多聚甲醛固定20min，去除固定液，用结晶紫染色5min，水洗5 次，加入10%的醋酸浸泡脱色，550nm 处酶标仪测定吸光度（OD）值，重复三次，取平均值。

1.2.6 细胞凋亡实验 取适量上述转染后的各组细胞，用结合缓冲液500uL 悬浮细胞，加入5μL Annexin V-APC 混匀后，再加入5μL PI，混匀；室温避光反应15min；采用流式细胞术检测细胞凋亡情况。

1.3 统计学方法 数据分析采用SPSS 25.0 统计软件，计量资料用均数±标准差，多组间采用单因素方差分析，组间比较采用Bonferroni 法，以P＜0.05 差异有统计学意义。

2 结果

2.1 下调lncRNA-ATB 基因效率验证 采用qRTPCR 检测各组lncRNA-ATB 的相对表达量，图1 可见，在MCF-7 细胞中，空白组、si-NC 组、si-ATB-1 组、si-ATB-2 组、si-ATB-3 组中lncRNA-ATB 相对表达量分别为1.01±0.13、1.09±0.04、0.16±0.01、0.41±0.03、0.27±0.02。可见si-ATB-1 组、si-ATB-2 组、si-ATB-3 组lnc RNA-ATB 的表达量显著低于空白组及NC 组（P＜0.05），空白组与NC 组无明显差异（P＞0.05）。在MDA-MB-231 细胞中，空白组、si-NC 组、si-ATB-1组、si-ATB-2 组、si-ATB-3 组lncRNA-ATB 表达量分别0.83±0.08、0.76±0.09、0.18±0.01、0.44±0.09、0.23±0.02。可见si-ATB-1 组、si-ATB-2 组、si-ATB-3组lncRNA-ATB 表达水平较空白组及NC 组明显降低（P＜0.05），空白组与NC 组无显著差异（P＞0.05）。在这两种细胞系中，si-ATB-1 组lncRNA-ATB 的表达量较si-ATB-2 及si-ATB-3 低，因此选择si-ATB-1 转染lncRNA-ATB 进行后续实验。

图1 MCF-7、MDA-MB-231细胞lncRNA-ATB表达水平比较与空白组及NC组比较，* P＜0.05

2.2 下调lnc RNA-ATB 后两种乳腺癌细胞克隆形成能力 图2 可见，两组细胞克隆集落生长情况有所差异，在MCF-7 细胞中，空白组、si-NC 组及si-ATB-1 组OD 值分别为1.343±0.010、1.327±0.003、0.985±0.007。si-ATB-1 组细胞OD 值明显较空白组及si-NC 组低（P＜0.05），空白组与si-NC 组无明显差异（P＞0.05）。在MDA- MB-231 细胞中，空白组、si-NC组及si-ATB-1 组OD 值分别为1.365±0.011、1.331±0.015、0.847±0.011，空白组及si-NC 组测得OD 值明显高于si-ATB-1 组（P＜0.05），空白组与si-NC 组间无显著差异（P＞0.05）。因此，我们发现下调lncRNA-ATB的表达可降低乳腺癌细胞克隆形成能力。

图2 下调lncRNA-ATB对MCF-7、MDA-MB-231细胞克隆形成能力的影响与空白组及NC组比较，* P＜0.05

2.3 下调lncRNA-ATB 后两种乳腺癌细胞迁移能力 图3 可见，在MCF-7 细胞及MDA-MB-231 细胞中下调lncRNA-ATB 后，采用Transwell 实验分析各组细胞迁移能力，MCF-7 细胞中空白组、si-NC 组、si-ATB-1组测得OD 值分别是0.734±0.026、0.730±0.027、0.551±0.019，si-ATB-1 组与空白组及NC 组比较OD值显著降低（P＜0.05），而空白组与NC 组无明显差异（P＞0.05）。MDA-MB-231 细胞中空白组、si-NC 组与si-ATB-1 组OD 值分别为1.507±0.026、1.432±0.037、1.140±0.067，si-ATB-1 组OD 值明显小于空白组及si-ATB-1 组（P＜0.05），空白组与NC 组差异无统计学意义（P＞0.05）。由此我们可见，下调lncRNA-ATB 后的两种乳腺癌细胞迁移能力明显下降。

图3 下调lncRNA-ATB对MCF-7、MDA-MB-231细胞transwell迁移能力的影响与空白组及NC组比较，*P＜0.05

2.4 下调lncRNA-ATB 对乳腺癌细胞凋亡的影响 图4 中，在MCF-7 细胞中，si-ATB-1 组、空白组及NC组细胞凋亡率分别为（7.19±0.26）%、（3.26±0.34）%、（2.61±0.32）%，下调lncRNA-ATB 的MCF-7 细胞凋亡率明显高于空白组及NC 组（P＜0.05）。在MDAMB-231 细胞中，si-ATB-1 组、空白组及NC 组细胞凋亡率分别为（6.88±0.17）%、（3.34±0.12）%、（3.35±0.14）%，空白组及NC 组细胞凋亡率明显低于si-ATB-1 组（P＜0.05），提示下调lncRNA-ATB 基因可促使乳腺癌细胞凋亡。

3 讨论

图4 下调lncRNA-ATB对MCF-7、MDA-MB-231细胞凋亡的影响与空白组及NC组相比，*P＜0.05

许多研究发现lncRNA-ATB 作为一种癌基因在多种恶性肿瘤组织中呈高表达，并且参与肿瘤细胞生长、侵袭、迁移和凋亡的过程。目前在BC 的相关研究中，也发现了其在BC 组织中表达水平明显高于相邻正常组织，但在BC 细胞水平的研究仍较少，因此，从细胞分子层面探索BC 的发生和转移侵袭的机制，将为BC 患者基因治疗提供新的靶点。

本实验通过特异s i R N A 靶向抑制B C 细胞lncRNA-ATB 的表达，再通过克隆平板形成实验，发现下调lncRNA-ATB 表达水平后BC 细胞的增殖能力明显下降。其可能的机制：（1）lncRNA-ATB 可作为一种竞争内源性RNA（ceRNA），竞争性结合miRNA 反应元件，从而影响下游靶基因的表达［8］，促进恶性肿瘤细胞的增殖。（2）miR-200c 被认为是lncRNA-ATB 直接结合位点，LncRNA-ATB 可通过抑制miR-200c 的水平进一步促进癌细胞的生长，同时上调miR-200 目标基因ZEB1 和ZEB2［9，10］。（3）LncRNA-ATB 还可以竞争性结合miR-590-5p 上调NF-90 水平影响肺鳞癌细胞增殖能力［11］。

之后，我们在两种转染siRNA-ATB 的BC 细胞中进行了transwell 迁移实验，我们发现下调lncRNA-ATB的BC 细胞组较阴性对照组迁移率显著降低，其机制离不开上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），上皮细胞失去黏附和紧密连接能力，获得间充质细胞的特性［12，13］。这个过程的发生伴随着上皮标记物E-钙黏蛋白（E-cadherin）表达水平的降低和间充质标记物N-钙黏蛋白（N-cadherin）和波形蛋白（vimentin）等的表达水平的升高［14］。一方面，lncRNA-ATB 可促进N-cadherin 和vimentin 的表达，抑制E-cadherin 的表达，从而促进EMT 的过程［11，15，16］；而另一方面，miRNA也可调控EMT 的过程，lnc RNA-ATB 通过TGF-β/ miR-200s / ZEB 轴诱导癌细胞EMT，促进癌细胞发生侵袭和迁移［2，3］。

最后，我们采用流式细胞术检测了下调lncRNAATB 的BC 细胞组和阴性对照组的细胞凋亡情况，实验发现前者细胞凋亡率明显提高，因此我们认为下调lncRNA-ATB 可促进BC 细胞凋亡。已有研究表明细胞凋亡程序失调导致肿瘤的发生，细胞凋亡程序的调控受到许多因素的调节，最常见的细胞凋亡因子包括B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）蛋白家族和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）。Bcl-2 蛋白家族由促凋亡因子和抗凋亡因子两组蛋白组成，Bax 作为Bcl-2 蛋白家族中的成员之一促进细胞的凋亡，而Bcl-2 作为Bcl-2 家族成员之一是一种抗凋亡因子，可以下调Bax 的表达从而以抑制凋亡的发生，促凋亡因子和抗凋亡因子之间的失衡导致细胞凋亡的失调；Caspases-3 是caspases 家族中重要的角色，它在多种凋亡因子的作用下激活，诱导细胞的凋亡［17］。下调lncRNA-ATB 的表达可下调Bcl-2、上调Bax 和激活caspase-3 来促进癌细胞凋亡［18］。

综上，lncRNA-ATB 在乳腺癌细胞的恶性生物学过程起重要的作用，下调lncRNA-ATB 的水平可使BC细胞的增殖和迁移能力明显下降，并促使BC 细胞的凋亡。因此，它有望成为BC 患者预后评估的生物学标志物和基因治疗的新靶点。