错配修复蛋白及PD-L1 在弥漫浸润型胃癌中的表达及意义

李 薇，王文杰，谷昀昌，虞红珍，程怀东

（安徽医科大学第二附属医院：1.肿瘤科；3.病理科，合肥 230601；2.安徽医科大学第二临床医学院2017级，合肥 23000）

胃癌是我国最常见的消化道恶性肿瘤，其中弥漫浸润型胃癌是具有独特生物学特性的一种亚型，易发生腹膜转移，常被漏诊误诊，化疗疗效欠佳，治疗方法有限，预后很差［1］。DNA 错配修复（mismatch repair，MMR）纠正DNA 复制过程中产生的错配，MMR 功能异常或缺失（Deficient mismatch repair，dMMR），导致表型突变和微卫星不稳定（Microsatellite instability，MSI），与恶性肿瘤的发生发展相关［2］。研究发现大肠癌、宫颈癌等多种恶性肿瘤中存在dMMR 与MSI［3-4］。程序性死亡蛋白 1（programmed cell death protein 1，PD-1）是B7 家族成员。PD-1 与配体PD-L1 结合后抑制T 细胞活化，从而抑制机体免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。研究发现肺癌、头颈部肿瘤、大肠癌等多种肿瘤组织中存在PD-L1 的阳性表达［5-7］，PD-1、PD-L1 免疫检查点抑制剂可解除PD-1/PD-L1 的免疫抑制，在多种进展期肿瘤中应用取得了一定的疗效［8］。目前弥漫浸润型胃癌发病机制尚不十分清楚。本研究通过探讨错配修复蛋白及PD-L1 对弥漫浸润型胃癌发生发展的影响，为临床应用检免疫查点抑制治疗提供一定的理论依据。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017 年1 月～2019 年8 月我院收治的弥漫浸润型胃癌，病理为印戒细胞癌或伴低分化腺癌，共选取患者33 例，其中男24 例，女9 例；年龄32～76 岁，平均年龄59 岁。

1.2 纳入标准与排除标准 纳入标准：（1）所有患者均确诊胃癌，接受了胃癌根治术，病理为弥漫浸润型印戒细胞癌伴低分化腺癌；（2）术前无化疗、放疗、靶向、免疫治疗等治疗史。排除标准：（1）患有重要脏器严重疾病；（2）严重免疫性疾患。

1.3 检测方法 错配修复蛋白MLHl、PMS2、MSH2、MSH6 表达检测方法：由组织蜡块切片，样品制备，经脱腊，抗原修复，内源性过氧化物酶阻断。再经一抗（MLH-1：迈新，MAB-0642；MSH-2：迈新，MAB-0291；MSH-6：迈新，MAB-0643；PMS-2：迈新，MAB-0656），二抗（安必平：Vbrightl）。然后经DAB 显色，苏木素复染，脱水透明封片后读片。阴性对照为磷酸盐缓冲液，阳性对照为选取已明确为阳性的标本切片。

PD-L1 表达检测方法：由组织蜡块切片，样品制备，脱腊，使用PT Link 仪器上的三合一流程进行脱蜡，水化和抗原修复。将带有切片的 Autostainer 切片架置于Autostainer Link 48 上，应用PD-L1 免疫组化诊断试剂盒 22C3 PharmDx，按照试剂盒流程进行。余按 MMR 检测流程进行复染及封片后读片。阴性对照为磷酸盐缓冲液，阳性对照为选取已明确为阳性的标本切片。

1.4 判定标准 错配修复蛋白阳性表达判断标准：MSH2、MLHl、MSH6、PMS2 蛋白在细胞核、细胞质表达，以细胞核为主，在肿瘤细胞明确着色黄色或棕黄色判定为阳性，任何比率肿瘤细胞的阳性均视为阳性，无着色判断为阴性。任一错配修复蛋白表达阴性即为错配修复功能缺陷（Deficient mismatch repair，dMMR），所有错配蛋白均阳性表达为错配修复功能正常（Proficient mismatch repair，pMMR）。

PD-L1 阳性表达判定标准：以联合阳性分数（Combined Positive Score，CPS）为判断标准，即任意强度膜染色的肿瘤细胞、与肿瘤细胞直接关联的膜/胞质染色的淋巴细胞、巨噬细胞数，相对于所有肿瘤细胞的比例分数，再乘以100。CPS 值大于1 即为PD-L1 表达阳性，反之为阴性。

1.5 观察结果 弥漫浸润型胃癌组织中MSH2、MLHl、MSH6、PMS2 及PD-L1 的表达情况。

1.6 统计学处理 本次研究数据处理使用SPSS 20.0统计学软件，计数资料以构成比描述，组间比较采用χ2检验，P＜0.05 具有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料 33 例胃癌患者，其中男性24 例，女性9 例；年龄32～76 岁，平均年龄59 岁。病灶主要浸润部位：胃底胃体2 例，胃体18 例，胃窦7 例，胃体胃窦3例，胃底胃窦1 例。伴有淋巴结转移11 例（33.3%）、脉管癌栓13 例（39.4%）、神经侵犯27 例（81.8%），癌组织发生嗜神经侵犯较淋巴结转移、脉管转移发生率明显升高（P＜0.05），见表1。

表1 一般资料

2.2 MSH2、MLHl、MSH6、PMS2 及PD-L1 阳性表达情况 33 例胃癌患者中，免疫组化检测MLHl、PMS2表达缺失发生各1 例，其余错配修复蛋白均为阳性表达；PD-L1 免疫组化检测表达均为阴性，见表2、图1。

表2 MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、PD-L1表达情况

图1 免疫组化

3 讨论

德国病理学家Borrmann 根据肿瘤蔓延浸润、以及肿瘤与周边组织边界情况将进展期胃癌分为Ⅰ～Ⅳ型，弥漫浸润型胃癌为Borrmann Ⅳ型，是进展期胃癌中少见的一种类型，易出现腹膜转移。内镜下观察病变处黏膜粗糙，呈结节状隆起或凹凸不平，黏膜充血、水肿、糜烂，或伴溃疡形成，而CT 多表现为胃壁局限性或广泛性不规则增厚，增强后增厚胃壁明显强化，病变组织与正常胃壁组织分界不清，胃腔变形或胃腔狭小，病变处胃浆膜面毛糙，与周围脂肪间隙模糊不清或消失，对于诊断Borrmann IV 型胃癌，CT 的准确性显著高于胃镜［9］。

弥漫浸润型胃癌以印戒细胞癌或低分化腺癌为主，易发生远处转移。本研究对33 例患者病理资料分析发现，伴有淋巴结转移11 例（33.3%）、脉管癌栓13 例（39.4%）、神经侵犯27 例（81.8%），癌组织发生神经侵犯较淋巴结转移、脉管转移发生率明显升高。胃癌亦是一种高度异质性肿瘤，这类胃癌嗜神经性机制尚不十分明确，是否有特殊的分子发病机制，值得进一步研究。

错配修复基因是一组高度保守的看家基因，通过编码错配修复蛋白修复 DNA 复制时出现的错配，维持基因组的稳定性。MMR 系统在参与DNA 修复时可涉及到多个错配修复蛋白，包括MutS（MSH2、MSH3 和 MSH6等）和MutL（MLH1、MLH3、PMS1 和 PMS2）两大家族，其中，MLH1、MSH2、MSH6、PMS2 是MMR 的主要蛋白，在DNA 错配修复时起关键作用［2］。这4 种MMR 蛋白中任意1 种及以上表达缺失判定为DNA 错配修复功能缺陷（dMMR），出现dMMR 的基因组稳定性就会降低，突变率升高。文献报道在结直肠癌等多种恶性肿瘤中存在一定的错配功能缺陷及微卫星不稳定，795 例结直肠癌肿瘤组织中，12.2%的CRC 具有MMR 蛋白缺陷（dMMR）表型，11.5%的CRC 具有较高的微卫星不稳定性，dMMR 是获得更好预后的独立预后因素［10］。而本研究检测发现在33 例弥漫浸润型胃癌中错配修复蛋白阳性表达率均较高，其中仅1 例MLH1、1 例PMS2 表达缺失，提示在弥漫浸润性胃癌中dMMR 发生率低，DNA突变率可能不高。本研究与日本学者Hirotsu 等报道十分相近，Hirotsu 研究中发现，38 例胃弥漫印戒细胞癌的MLH1、MSH2、MSH6、PMS2 蛋白免疫组化染色，所有胃肿瘤组织都表达MMR 蛋白，未发现1 例dMMR，在该研究中进一步查询了癌症基因组图谱（TCGA）基因组数据库，发现99 例弥漫型胃癌样本中只有6 例（6%）显示MMR 不足［11］。另外，Tamura 等在其研究中报道了在胃弥漫印戒细胞癌中没有发现MSIH（0/14，0%），与本研究亦较为一致［12］，因此提示DNA 错配修复功能异常可能不是弥漫浸润型胃癌主要的发病机制。

程序性死亡蛋白 1（programmed cell death protein 1，PD-1）是B7 家族成员，是活化的T 细胞，特别是细胞毒性T 细胞、B 细胞、单核细胞和自然杀伤细胞上表达的关键抑制性受体。PD-1 具有两种配体：程序性死亡配体 1（programmed death-ligand 1，PD-L1）和 PD-L2。PD-1/PD-L1 结合后抑制T 细胞活化，导致肿瘤的免疫逃逸。研究认为多种恶性肿瘤细胞存在PD-L1 的表达［13］。而在本研究中，33 例弥漫浸润型胃癌组织中未发现PD-L1 的阳性表达，这可能与样本量少有关，提示了在弥漫浸润型胃癌中PD-L1 阳性表达率不高。日本学者Jin 亦发现243 例胃癌组织中PD-L1 阳性表达率43%，所有PD-L1 阳性中弥漫型胃癌组织阳性表达率仅为31%，明显低于Lauren 肠型［14］，与本研究结果较为相似。免疫检查点抑制剂可以解除免疫抑制，提高抗肿瘤 T 细胞的活性，增强抗肿瘤能力，但本研究提示应用免疫检查点抑制剂治疗弥漫浸润型胃癌有效率可能不高。

DNA 错配修复功能缺陷可能不是弥漫浸润型胃癌的主要发病机制，应用免疫检查点抑制剂治疗临床获益的可能性不大。本研究检测结果或许与样本量不大有关，再者PD-L1 在肿瘤或免疫细胞的表达虽重要，但并非绝对的疗效预测性生物标志，还有哪些？另外发现弥漫浸润型胃癌中嗜神经侵犯的发生率明显淋巴结转移、血行转移，究其原因？这些都有待于在今后工作中进一步研究。