T-SPOT.TB、TB-LAMP、TB-DNA 定量对肺结核的诊断价值分析

李秀萍，赵雪梅，严晓芸，李 叶，王 玲，董 力，魏连存

（青海省第四人民医院，西宁 810000）

肺结核是由结核分枝杆菌传染而引起的慢性传染性疾病，是我国的高发性传染病，可累及机体多个器官，以肺部感染最常见，主要表现为午后低热、盗汗、乏力、消瘦、咳嗽咳痰、咯血、呼吸困难等，严重威胁国民的生活质量与生命健康［1-2］。研究表明，结核杆菌入侵人体后不一定会即刻致病，若能早诊断，早治疗，肺结核患者大多可临床治愈，预后良好［3］。长期以来，痰培养是临床诊断肺结核的金标准，但近年来，如γ干扰素释放试验（Tuberculous bacillus-interferon release test，T-SPOT.TB）、实时荧光核酸恒温扩增技术（Real-time fluorescent nucleic acid thermostatic amplification technology，SATTB）、肺结核核酸（Tuberculous bacillus-DNA，TB-DNA）定量等多种新型诊断技术可在分子水平对肺结核进行检测，为肺结核患者的诊断带来了新可能［4-5］。在上述研究背景下，本研究分别采用了T-SPOT.TB、SAT-TB、TB-DNA 定量对肺结核进行诊断，来探讨其诊断价值，旨为临床诊断肺结核提供一种新视角。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018 年1 月～2020 年6 月本院的疑似肺结核患者153 例，一般资料见后述。纳入标准：均为疑似肺结核患者。排除标准：合并有除肺结核外其他传染性疾病者；合并凝血功能障碍者；合并免疫功能障碍者；合并恶性肿瘤者。按痰培养确诊后结果分为肺结核组（n=78）与非肺结核组（n=75）。本研究经本院医学伦理委员会会议表决通过。

1.2 检测方法

1.2.1 痰培养试验 采集患者痰标本后用齐尔-尼尔森染色法对其进行染色，试剂均购自北京凯瑞基生物科技有限公司，具体操作流程与评判标准均严格参照相关文献标准［6］。

1.2.2 T-SPOT.TB 采集患者外周静脉血清5mL，置于抗凝管内加肝素保存备用。用结核感染T 细胞实验试剂盒检测患者外周静脉血清，记录斑点数，评判标准：A 孔或B 孔斑点数≥6 即为阳性，反之为阴性。试剂盒均购自上海江莱生物科技有限公司，相关操作流程均严格参照试剂说明书。

1.2.3 SAT-TB 采集患者痰标本后用SAT-TB 试剂盒对其中的分枝杆菌DNA 进行提取、扩增，扩增完成后用荧光检测仪（美国GE，6022T）检测样本是否有荧光显示，有为阳性，无为阴性。相关操作流程均严格参照仪器和试剂说明书，试剂盒均购自上海江莱生物科技有限公司。

1.2.4 TB-DNA 定量 采集患者痰标本后用FQ-PCR仪（美国ABI，QuantStudio3）对其中的分枝杆菌DNA 进行扩增，用荧光定量检测试剂盒检测其DNA 表达量，结果以＞50 拷贝为阳性，反之为阴性。相关操作流程均严格参照仪器和试剂说明书，试剂盒均购自上海江莱生物科技有限公司。

1.3 观察指标 对所有患者均行T-SPOT.TB、SATTB、TB-DNA 定量检测，观察比较三种检测方法诊断肺结核的敏感度、特异度、准确度、阳性预测值、阴性预测值、kappa 值。

1.4 统计学方法 使用SPSS 23.0 进行研究资料分析。观测资料中的计量数据，均通过正态性检验，以mean±SD 描述。两组间的比较为成组t 检验或校正t 检验（统计量为t）。 计数资料以例数及率描述。组间比较为卡方检验或校正卡方检验（统计量为χ2）。诊断评估价值分析为配对卡方检验及ROC（receiver operation characteristic，接收者工作特征曲线）分析。 统计推断的检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 肺结核组与非肺结核组一般资料比较 肺结核组与非肺结核组在年龄、性别、吸烟史、血压、心率上均无明显差异（P＞0.05）（表1）。

表1 肺结核组与非肺结核组一般资料比较

2.2 三种检测方法的诊断敏感度、特异度、准确度、阳性预测值、阴性预测值、kappa 值比较 T-SPOT.TB、SAT-TB、TB-DNA 定量三种检测方法诊断肺结核的敏感度%分别为93.6、83.3、71.8，特异度%分别为96.0、96.0、97.3，准确度%分别为94.1、83.7、70.6，三组差异均具有统计学意义（P＜0.05）。其中，T-SPOT.TB 诊断肺结核的敏感度、特异度、准确度均大于SAT-TB、TBDNA 定量检测，差异均具有统计学意义（P＜0.05），见表2，表3，ROC 曲线见图1。

三种检测方法的kappa 值分别为0.882、0.673、0.411，T-SPOT.TB 的kappa 值均大于SAT-TB、TB-DNA定量的kappa 值。

表2 三种方法在各组中的检测结果（例，n）

表3 三种检测方法的诊断敏感度、特异度、准确度比较，n（%）

2.3 三种方法间联合检测的诊断敏感度、特异度、准确度、阳性预测值、阴性预测值、kappa 值比较 根据临床习惯做法，设计了T-SPOT.TB+另外两种方法的联合应用，共3 种（T-SPOT.TB+SAT-TB，T-SPOT.TB+TBDNA，T-SPOT.TB+SAT-TB+TB-DNA）。经观测，三种联合检测方法的诊断敏感度、特异度、准确度均无统计学差异（P＞0.05），见表4，ROC 曲线见图1。

结合前述表3 结果来看，三种联合检测方法的诊断敏感度、特异度、准确度仅略高于T-SPOT.TB 的单独应用。

表4 三种方法间联合检测的诊断敏感度、特异度、准确度比较，n（%）

3 讨论

肺结核是由结核分枝杆菌引起的肺部感染性疾病，主要通过呼吸道飞沫传播，传染性强，全世界每年的肺结核发病人数逾千万，我国是典型的肺结核疫情高负担国家，发病人数高居全球第2，如何防治肺结核已成为我国乃至世界亟待解决的重大公共卫生问题［7］。研究表明，结核分枝杆菌的感染、潜伏与人类的SLC11A1 基因多态性与人群易感性有关，其致病多具有条件性，感染早期患者多无自觉症状，当由于内、外界因素而导致人体免疫功能下降、细菌大量繁殖或细胞介导的炎症反应加强时才得以致病，因此寻求多方面、有效的诊断方式成为临床防治肺结核的关键［8］。T-SPOT.TB、SAT-TB、TB-DNA 定量作为临床诊断肺结核的新兴技术，其诊断价值孰大孰小尚未明了［9］。现为比较T-SPOT.TB、SATTB、TB-DNA 定量对肺结核的诊断价值，特做此研究。

本研究结果显示，T-SPOT.TB、SAT-TB、TB-DNA定量等三种方法间联合检测的诊断效能较单独检测提高不多，且T-SPOT.TB 诊断肺结核的敏感度、特异度、准确度、阳性预测值、阴性预测值、kappa 值均明显大于SAT-TB、TB-DNA 定量检测，提示相比联合检测与SAT-TB、TB-DNA 定量检测，T-SPOT.TB 具有很强的鉴别肺结核能力，能更准确地判断受检者是否真实患有肺结核，甚至与作为肺结核诊断金标准的痰培养检测具有较高的一致性。

究其原因，可能是因为结核分枝杆菌的致病过程主要可分为起始期、T 细胞反应期、共生期和细胞外繁殖传播期［10］。侵入呼吸道的结核菌被肺泡巨噬细胞吞噬，而后在肺泡巨噬细胞内存活和复制，扩散至邻近非活化的肺泡巨噬细胞和形成早期感染灶。在T 细胞反应期，结核菌在巨噬细胞内继续生长，引发由T 细胞介导的细胞免疫和迟发性变态反应，形成中心呈固态干酪坏死的结核灶，从而限制结核菌继续复制，这一病理过程对结核病的发生发展及预后转归起着决定性作用，且大多数感染者均可发展至T 细胞反应期，因此这一时期也成为肺结核的标志性病理生理时期［11-12］。T-SPOT.TB 利用了酶联免疫斑点技术以及特异度抗原ESAT-6、CFP-10，能通过记录斑点数反映由结核分枝杆菌引起、由T 细胞介导的细胞免疫反应过程中产生的效应T 淋巴细胞数量，从而反映患者是否存在T 细胞反应期，并以此来判断患者是否存在结合分枝杆菌感染［13］。相反，SAT-TB、TB-DNA 定量检测均使用到了DNA 扩增技术，在DNA 扩增过程中，由于容易出现实验器材污染的问题，易造成误差，并加以放大，从而出现假阳性，而结核分枝杆菌作为L 型细菌，由于缺壁并合有代偿性细胞膜增厚，一般常用溶菌酶难以使其细胞膜破裂释出DNA，从而又容易出现假阴性［14］，降低了诊断效能。ZHANG Yumeng 等人［15］的研究表明，T-SPOT.TB、TB-DNA 定量的敏感性分别为96%、64%，特异度分别为88%、67%，且T-SPOT.TB 与联合痰培养能提高肺结核的诊断阳性率；Linchuan 等人［16］的研究表明，T-SPOT.TB 可不受实验样本采集的影响，诊断活肺结核的阳性率、灵敏度均高于SAT-TB，且对活动性肺结核亦具有较高的诊断特异度；Tong-Tong Y 等人［17］的研究表明，T-SPOT.TB 可提高结核菌素试验阴性、TB-DNA 定量检测阴性患者中结核分枝杆菌的发现率，提高耐药性肺结核的诊断效能。上述研究报道均与本研究结果相一致。而联合检测法的诊断效能并不非常高于T-SPOT.TB 单独检测法，可能是因为T-SPOT.TB主要利用免疫反应来实现检测目的，与SAT-TB、TBDNA 定量利用DNA 扩增的检测原理相差较大，在检测阳性率上较难达成一致，从而造成了T-SPOT.TB 检测方法“一枝独秀”，而其它两法诊断效能较低的现象。

T-SPOT.TB 对肺结核的诊断价值要大于SAT-TB、TB-DNA 定量检测，有望成为替代痰培养的检测方法，值得临床进一步推广应用。