MMP-2、AIM2 在直肠癌组织中的表达及其与新辅助放化疗 疗效的关系

饶贵安，倪 眺，陈 强，苏 艺

（梧州市红十字会医院胃肠外科，梧州 543002）

直肠癌是消化系统常见恶性肿瘤，在消化系统肿瘤中发病率居第二位，流行病学研究显示其发病率呈上升趋势［1］。目前局部进展期直肠癌的治疗以手术方式为主，而术前通过新辅助放化疗（neoadjuvant chemoradiotherapy，nCRT）实现肿瘤降期，能显著改善局部复发、增加保肛率和总体生存［2，3］。但在临床实践中，基于个体差异，并非全部患者均能通过nCRT 辅助治疗获益，相反对于nCRT 敏感性差的患者还可能延误治疗时间、承受不必要的放化疗毒副作用［4］。因此寻找能预测局部进展期直肠癌nCRT 敏感性的分子标志物具有重要的临床意义，成为临床治疗中亟待解决的问题。已有研究［5］显示，基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP-2）在肿瘤浸润、迁移中具有重要作用，且在放化疗前后表达存在明显差异。黑色素瘤缺乏因子2（absent in melanoma 2，AIM2）在放疗诱导的细胞死亡及组织损伤中具有重要作用，可能是nCRT疗效的潜在预测因子［6］。本研究通过检测放化疗前局部进展期直肠癌患癌组织MMP-2 和AIM2 表达情况，并探讨其预测nCRT 疗效的临床价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2018 年10 月～2019 年10 月本院98 例行新辅助放化疗的局部进展期直肠癌患者为研究对象，年龄37～79（61.81±9.48）岁。纳入标准：（1）符合直肠癌临床诊断，并经术前肠镜活检诊断局部进展期直肠癌；（2）年龄18 岁以上；（3）接受术前新辅助放化疗治疗者；（4）研究取得患者知情同意。排除标准：（1）合并其他系统原发性肿瘤的患者；（2）放化疗后未行肿瘤切除手术者；（3）不能配合完成本次研究者；（4）临床病例资料不完整者。收集所有患者放化疗前活检石蜡标本及临床资料。

1.2 新辅助放化疗方法及疗效评估 患者于术前接受同步放化疗治疗。采用三维适形全盆腔放疗方式，总剂量50Gy，分25 次完成，同步化疗方案采取FOLFOX方案2～3 个周期。新辅助放化疗疗效评估参照文献［7］采用肿瘤消退程度分级（tumor regression grading，TRG）进行评定：TRG0，肿瘤无消退；TRG1，肿瘤轻微消退，肿瘤组织部分纤维化，但不超过25%；TRG2，肿瘤中度消退，纤维化成分占约26%～50%；TRG3，肿瘤消退良好，纤维化成分占50%以上；TRG4，肿瘤完全消退，无肿瘤细胞，仅见纤维化组织。其中TRG 0～2 判定为nCRT 不敏感，TRG 3～4 判定为nCRT 敏感［8］。

1.3 免疫组化检测MMP-2、AIM2 蛋白表达

1.3.1 主要试剂 兔抗人MMP-2、AIM2 抗体（美国Sigma 公司），Envision 法免疫组织化学试剂盒（丹麦DAKO 公司），DAB 显色试剂盒（丹麦DAKO 公司），羊抗兔IgG 二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司）。

1.3.2 免疫组化染色及判定标准 石蜡包埋的组织标本4μm 连续切片至过胶玻片上，56℃条件下烤片2h，使用二甲苯连续脱蜡3 次，梯度乙醇脱二甲苯，水洗。0.3%过氧化氢室温孵育以阻断内源性过氧化物酶的活性。采用免疫组化Envision 法染色，染色步骤严格按说明书要求进行，采用DAB 显色，严格控制显色时间，常规脱水、封片。使用已知阳性切片作为阳性对照，PBS替代MMP-2、AIM2 一抗作为阴性对照。显微镜下随机选取5 个切片视野（×200），再从各视野中观察100个细胞，采用病理Path 软件分析显微镜下细胞分布情况。判定标准：AIM2 及MMP-2 主要定位于细胞质，以细胞质染色强度结合阳性细胞百分比对其表达情况进行判读，计算阳性细胞百分比并赋予分值，0%计为0分，～10%为1 分，～30%为2 分，～50%计3 分，50%及以上计4 分；观察染色强度并赋予分值，无色计0 分，弱染色计1 分，适度染色计2 分，强染色计3 分。以上两项分值乘积＜3 分为阴性（-），≥3 分为阳性（+）。

1.4 统计学处理 使用SPSS 20.0 软件进行数据统计分析，计数资料采用率表示，采取χ2检验；直肠癌nCRT 疗效的独立影响因素采用多因素Logistic 回归模型分析；应用受试者工作特征（ROC）曲线及曲线下面积（AUC）评价各指标的诊断效能，AUC 比较使用Z 检验。所有检验均采取双侧检验，以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MMP-2 与AIM 2 蛋白表达与新辅助放化疗疗效的关系 98 例接受术前nCRT 的患者中，61 例对nCRT治疗敏感，其余37 例对nCRT 治疗不敏感。nCRT 敏感组MMP-2 及AIM2 蛋白阳性表达率均显著高于nCRT不敏感组（均P＜0.05），见表1。

表1 MMP-2与AIM2蛋白表达与新辅助放化疗疗效的关系（例，%）

2.2 nCRT 敏感组与nCRT 不敏感组临床特征比较 对nCRT 敏感组与nCRT 不敏感组临床特征进行分析，结果提示放化疗前血清CEA 水平与直肠癌对nCRT 治疗敏感与否显著相关（P＜0.05），而年龄、性别、肿瘤位置、分化类型、临床分期、临床淋巴结分期与nCRT 治疗敏感与否无关（均P＞0.05），见表2。

2.3 直肠癌nCRT 疗效影响因素的多因素Logistic 回归分析 以直肠癌患者对新辅助放化疗是否敏感作为因变量（1=敏感，0=不敏感），?将表1 和表2 中有统计学差异的变量作为自变量纳入多因素Logistic 回归分析，结果提示MMP-2 阳性、AIM2 阳性是直肠癌对nCRT 敏感的独立影响因素（均P＜0.05），见表3。

2.4 ROC 曲线分析MMP-2、AIM 2 表达对直肠癌nCRT 疗效的预测价值 绘制放化疗前直肠癌组织中MMP-2、AIM2 蛋白及血清CEA 预测nCRT 疗效的ROC曲线，见图1。AIM2 预测nCRT 疗效的AUC 分别大于CEA（Z=3.481，P=0.000）、MMP-2（Z=2.822，P=0.005）预测nCRT 疗效的AUC，见表4。

3 讨论

临床研究表明对局部进展期直肠癌患者在实施手术前通过nCRT 辅助治疗可使患者明显获益。然而既往大量的临床实践发现，并非所有局部进展期直肠癌患者均对nCRT 辅助治疗敏感，肿瘤的消退程度个体差异明显，而在一些敏感性差的患者存在严重的nCRT 治疗相关不良反应［2］。此外，行nCRT 治疗期间，一部分患者出现病情进展，甚至发生直肠癌远处转移，丧失手术治疗机会。因此探讨能预测直肠癌nCRT 疗效的指标具有显著的临床意义，有助于减轻患者负担，帮助临床医师实现精准化、个体化治疗。既往研究［9］显示，血清CEA 水平与nCRT 敏感性具有密切联系，CEA 水平低的患者放化疗疗效更好。本研究也有类似发现，放化疗前血清CEA 水平与直肠癌患者对nCRT 治疗的敏感性明显相关，但ROC 曲线分析显示其AUC 在0.5～0.7之间，因此预测效能不高。

表2 nCRT敏感组与nCRT不敏感组临床特征比较

表3 直肠癌nCRT疗效影响因素的多因素Logistic回归分析

图1 MMP-2、AIM2及CEA预测直肠癌nCRT疗效的ROC曲线

表4 MMP-2、AIM2及CEA预测直肠癌nCRT疗效的效能比较

基质金属蛋白酶是一组依赖于锌离子的具有降解细胞外基质活性的内肽酶家族，已被大量报道证实在肿瘤生长、侵袭及转移过程中发挥关键作用［10］。MMP-2 归属于基质蛋白酶基质中的明胶酶类，已有资料［11］表明，MMP-2 能够介导肿瘤细胞外基质降解，这一功能在多种肿瘤的癌细胞浸润和转移中具有关键性作用。另外，报道显示MMP-2 参与调节、降低肿瘤细胞间粘附力，使其易于脱落而形成远处转移。既往报道［12］中，新辅助化疗能通过降低乳腺癌MMP-2 表达，抑制乳腺癌细胞侵袭力，从而减少乳腺癌的侵袭转移。本研究中，nCRT 敏感组MMP-2 阳性表达率明显高于nCRT 不敏感组，提示放化疗前直肠癌组织中MMP-2 表达水平与nCRT 治疗效果密切相关。经多因素Logistic 回归分析提示MMP-2 阳性表达是直肠癌nCRT 疗效的独立影响因素，提示MMP-2 可能是预测nCRT 疗效的潜在生物标志物。为进一步评价放化疗前肿瘤组织中MMP-2 在预测nCRT 疗效中的价值，本研究利用ROC 曲线评价，结果表明MMP-2 预测nCRT疗效具有一定价值，ROC 曲线下面积均大于0.7。但MMP-2 过表达影响nCRT 敏感性的相关机制仍有待进一步明确。

AIM2 是一种模式识别受体，生理情况下AIM2 通过识别外源性细菌、病毒甚至自身双链DNA 等病原体相关分子模式（PAMPs），并进一步激活炎症小体途径以对抗外源性感染因素或清除自身损伤相关分子［13，14］。局部进展期直肠癌患者肿瘤细胞受nCRT 作用后，可以发生AIM2 聚集现象［15］。本研究中，AIM2 是直肠癌nCRT 疗效的独立影响因素，经ROC 曲线分析发现AIM2 预测nCRT 疗效价值较高，其预测效能明显高于MMP-2 和CEA。AIM2 过表达如何导致直肠癌对新辅助放化疗耐受的机制目前不明。近来研究发现，在放化疗导致的机体细胞DNA 破坏时，细胞核中的AIM2蛋白与受损的双链DNA 结合，可以合成炎症复合体，激活Caspase-1 并介导IL-1β引发的细胞凋亡［16］。笔者推测AIM2 作为一种模式识别受体，通过识别放化疗损伤的肿瘤细胞DNA 并进一步激活凋亡相关信号通路可能是AIM2 影响nCRT 敏感性的相关机制，但仍有待进一步明确。

综上所述，局部进展期直肠癌放化疗前肿瘤组织中MMP-2、AIM2 阳性表达的患者更易获得较好的nCRT 治疗疗效，二者对nCRT 疗效具有较好的预测价值，但相关作用机制有待进一步研究探讨。