长链非编码RNA CCAT1可作为肝细胞癌血浆标志物并预测其治疗效果

张彬彬 郁皓 曹斐 吴晓霞 单永锋 王昊楠 刘慧

常用的筛查肝细胞癌(HCC)的手段是AFP检测联合超声多普勒检查，然而，AFP检测早期HCC的敏感度只有39%～65%[1]。目前众多的lncRNA在肿瘤患者血清中被发现高表达，预测其可能作为肿瘤的诊断标志物[2-7]。结肠癌相关转录因子1(colon cancer associated transcript 1，CCAT1)被发现在结直肠癌、胃癌、肝细胞癌、胆囊癌、乳腺癌等多种肿瘤组织中高表达，并具有促进肿瘤增殖、侵袭和迁移的作用，并与肿瘤的不良预后相关，可作为潜在的预后标志物[4，8-11]。本研究首次检测CCAT1在HCC患者血液中的表达水平，探索其作为诊断HCC的血液标志物的可能性，并研究其在HCC介入或射频前后的表达水平。

材料与方法

一、研究对象

收集江苏省无锡市第五人民医院2017年到2019年期间66例肝癌患者血液标本，并收集50例年龄、性别相匹配的健康成人对照。其中肝癌组的37例患者经介入或射频治疗，并留取治疗后1个月左右的血液标本。静脉采血后2 h内3 000 r/min 4 ℃低温离心15 min，收集血浆，分装到离心管中，每管500 μL冻存在-80 ℃。所有样本采集均得到患者知情同意。所有样本使用取得无锡市第五人民医院伦理委员会同意及支持。

二、RNA提取及实时定量PCR

TRIzol LS Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 被用来提取血浆总RNA，具体步骤根据产品说明书。RNA被逆转录为cDNA应用HiScript III RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)(Vazyme，南京，中国)。使用Fast Probe Mixture(CWBIO，北京，中国)进行定量PCR反应，2 μL cDNA被用来作为反应模板。反应条件：95 ℃ 10 min预变性，随后95 ℃ 15 s变性，65 ℃ 1 min扩增，共40个循环。β-actin被作为内源性标志物。引物序列如下: CCAT1, 5′-CATTGGGA-AAGGTGCCGAGA-3′ (sense) and 5′-ACGCTTAGCC-ATACAGAGCC-3′ (anti-sense)；β-actin, 5′-TCCTCTC-CCAAGTCCACACA-3′ (sense) and 5′-GCACGAAG-GCTCATCATTCA-3′ (anti-sense)。

三、统计学分析

应用SPSS18.0软件用来分析数据，采用U检验比较各组血浆CCAT1水平。分组资料分析采用卡方检验。应用ROC曲线评价血浆CCAT1对HCC的诊断价值。P<0.05被认为具有统计学价值。

结 果

一、HCC患者血浆CCAT1表达水平增加及其诊断价值

采用逆转录PCR法检测各组血浆CCAT1的相对表达情况并进行分析，结果显示，66例HCC患者血浆CCAT1表达水平明显高于50例健康志愿者(P=0.016)。

通过ROC曲线分析来评估血清CCAT1是否可以作为HCC的潜在生物标志物。结果表明，血浆CCAT1可区分HCC患者与正常对照组，其ROC曲线下面积为0.782(95%CI：0.692～0.873，P<0.001)。在截断值为0.010 3时，敏感度和特异度分别为68.6%和69.8%，对HCC的诊断有一定的价值。

二、HCC患者经治疗后血浆CCAT1表达水平较前下降

37例HCC患者经射频消融或肝动脉介入化疗后检测血浆中CCAT1表达水平，结果表明，CCAT1表达较治疗前下降(P=0.003)，揭示了CCAT1的表达水平的变化可能作为判断HCC治疗效果的血液标志物。

三、CCAT1的表达水平及其与HCC临床病理参数的相关性

研究表明，多种在HCC组织中异常表达的lncRNA呈现出与肿瘤患者临床病理参数之间的相关性，因此我们分析了血浆中CCAT1的表达水平与HCC患者临床病理特点之间的关系。根据CCAT1的中位表达水平将所有患者分为低表达组和高表达组，如表1所示，血浆中CCAT1的表达水平与HCC患者的BCLC分期相关，BCLC分期越高，则CCAT1的表达水平越高。CCTA1的表达水平与HCC患者的性别、年龄、肿瘤数目、肿瘤大小、Child分级、AFP水平未表现出明显关系。

表1 66例肝癌患者血浆中CCAT1的表达水平

讨 论

截至目前，HCC的发生机制仍未完全阐明。众多研究报道，多种lncRNA均参与HCC的发生、发展，例如lncRNA TUG1、CASC9、HULC、PTTG3P等[12-14]。最新研究发现，CCAT1在HCC组织中高表达，其通过与miR-181a竞争性结合调节HCC细胞的增殖及自噬[15]。另有研究发现，CCAT1在结直肠癌患者的血液中高表达，其与HOTAIR联合检测用于预测结直肠癌的患病率其敏感度及特异度均较高[4]，这表明CCAT1可在肿瘤患者血液中稳定表达。本研究旨在探讨CCAT1在HCC患者血浆中的表达水平，并分析其作为HCC血液标志物及治疗评估标志物的可能性。

本研究检测了66例HCC患者与50例健康成年人血浆中CCAT1的表达水平，发现CCAT1在HCC患者血浆中的表达水平较高，且患者的BCLC分期越高，则CCAT1的表达水平越高，这表明检测血浆CCAT1的表达水平可能可以区分HCC患者及健康成年人，其表达水平越高，则提示病情越晚，这对HCC的诊断及病情判断有一定的价值。66例HCC患者中，有37例患者是行射频或介入治疗的，比较了治疗前与治疗后1个月左右CCAT1的表达水平，结果显示，经射频或介入治疗后CCAT1的表达水平明显下降，提示CCAT1可能作为预测HCC治疗效果的肿瘤标志物。本研究亦存在许多需进一步完善之处，后续应扩大样本量，延长随访时间，尽量取得相同患者不同时间点的血液标本，横向比较CCAT1在整个病程中的变化，及其与生存时间的相关性。

综上所述，本研究提示CCAT1可作为HCC的血液标志物，并可预测其治疗效果。