三黄泻心汤三味药联合抗生素对幽门螺杆菌的体外抑菌实验研究

耿 聪，李 岩,姚鑫洁

0 引言

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)感染与慢性胃炎、胃溃疡、胃癌、胃Malt淋巴瘤等疾病的发生发展密切相关[1-4]，故Hp的根除有重要的临床意义。近年来，Hp的根除率逐年下降，这主要与其对相关抗生素的耐药有关[4-6]，耐药率最高的3种抗生素为克拉霉素(Clarithromycin,CLR)、左氧氟沙星(Levofloxacin,LEV)、甲硝唑(Metronidazole,MTZ)[7-8]。近年来，中西药联合应用使Hp根除率有所提高[6]。一些研究已证实，三黄泻心汤组方及其组成大黄、黄连、黄芩及三味中药的有效成分：黄连(小檗碱/黄连素、黄连碱、巴马汀)、大黄(大黄酸、大黄素)、黄芩(黄芩苷、黄芩素)有体外抑杀Hp的作用[9-13]，但有关三味中药之间及三味中药与抗生素联合应用的抑菌效果是否存在抗菌增敏的研究尚未见报道。本项研究对组成三黄泻心汤的大黄、黄连、黄芩进行体外抑菌实验，探讨三味中药之间的联合抑菌效果及三味中药与CLR、LEV、MTZ的联合抑菌效果，为临床应用三黄泻心汤及三味中药在根除Hp治疗中的方案制定提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验菌株 Hp菌株ATCC43504(中国疾病预防控制中心赠予)。ATCC43504菌株为美国临床实验室标准化协会(CLSI)细菌药敏实验执行指南推荐的质控菌株。菌株为CLR、LEV的敏感菌株，为MTZ的耐药菌株。

1.1.2 主要药物及试剂 中药生药黄连、大黄、黄芩(沈阳市中医院)，克拉霉素、左氧氟沙星、甲硝唑标准品(美仑，批号：MB1058-S、MB1076-S、MB2200-S)，Karmali固体培养基试剂(OXOID，货号:CM0935)，幽门螺杆菌选择性添加剂(OXOID，货号:SR0147E)，PBS缓冲液(美仑，批号：MA0015)，DMSO(索莱宝，批号：D8370-100)，冰醋酸(大茂化学试剂厂)。

1.1.3 主要设备 真空冷冻干燥机(宁波新芝生物科技股份有限公司，型号：SCIENTZ-12N)，超净工作台(青岛海尔公司，型号：HR40-IIA2)，恒温培养箱(上海精宏设备公司，型号:DNP-9162)，电热恒温水浴锅(上海森信仪器公司，型号:DK-S24)。

1.2 方法

1.2.1 实验药液的制备 中药：大黄、黄连、黄芩分别置于砂锅中，8倍量(按质量算)冷水浸泡1 h，武火煮沸后文火煎30 min，滤出药液留存，所剩药渣再加适量冷水重复以上煎煮及滤出过程，合并两次滤液。所有滤液经真空冷冻干燥机处理后形成粉剂，用双蒸水按生药质量计算配成浓度为1 g/ml的药液，作为实验药液的母液，密封冷藏保存。

抗生素：根据CLSI细菌药敏实验执行指南，分别应用DMSO溶解MTZ、冰醋酸溶解CLR及LEV，并分别用PBS缓冲液对CLR、双蒸水对MTZ及LEV加以稀释，参照CLSI指南规定的Hp菌株ATCC43504对抗生素的质控范围(表1)，将MTZ、LEV、CLR标准品配成浓度为MTZ 5 120 mg/L、LEV 5 mg/L、CLR 5 mg/L的溶液(药液浓度至少为质控范围高值的10倍)，以此作为实验药液的母液，密封冷藏保存。

采用二倍稀释法将实验药液母液稀释成如下的浓度：参照文献[9]将大黄、黄连、黄芩用双蒸水分别稀释成1∶10(100 mg/ml)、1∶20(50 mg/ml)、1∶40(25 mg/ml)、1∶80(12.5 mg/ml)、1∶160(6.25 mg/ml)、1∶320(3.12 mg/ml)、1∶640(1.56 mg/ml)7种不同浓度的药液；参照ATCC43504对抗生素的质控范围，将抗生素制成如下浓度药液：CLR：2.5、1.25、0.625、0.31、0.16、0.08 mg/L；LEV：5、2.5、1.25、0.625、0.31、0.16、0.08 mg/L；MTZ：5 120、2 560、1 280、640、320 mg/L。将以上6种药物的共计39种浓度的药液密封冷藏保存，备用于后续单药药敏实验及联合药敏实验中含药培养基的制备。

1.2.2 Hp培养基的制备 普通培养基：Karmali固体培养基试剂21.5 g+双蒸水475 ml，121 ℃高压灭菌15 min，待温度降至50 ℃左右，加入脱纤维羊血25 ml、Hp选择性添加剂1瓶，混合均匀后吸取20 ml加入无菌平皿，待琼脂冷却，将培养皿倒置，冷藏保存。

含药培养基：Karmali固体培养基试剂21.5 g+双蒸水425 ml，121 ℃高压灭菌15 min，待温度降至50 ℃左右，加入脱纤维羊血25 ml、Hp选择性添加剂1瓶，混合均匀后吸取18 ml加入无菌平皿，另加入不同成分、不同浓度的实验药液2 ml，混匀，待凝固后倒置冷藏保存。

1.2.3 Hp培养、鉴定、传代 将保存的Hp菌株ATCC43504接种到普通培养基，将培养皿倒置，于37 ℃、微需氧环境培养3 d，经尿素酶试验、过氧化物酶试验鉴定证实为Hp。菌株传代扩增菌量，备用于后续药敏实验。Hp菌液的制备：Hp菌株于上述条件下培养3 d，用无菌接种环刮取适量菌落，置于生理盐水中，用移液器吹打均匀，制成麦氏浊度为2的菌液，立即用于药敏实验。

1.2.4 药敏实验 单药药敏实验。(1)药敏纸片法。①制作中药药敏纸片：直径6 mm的空白药敏纸片分别滴入25 μl的1 g/ml的大黄、黄连、黄芩药液，空白药敏纸片滴加25 μl无菌双蒸水做对照，放置于超净工作台中待纸片干燥。②接种Hp：90 μl麦氏浊度为2的菌液滴入上述普通培养基，棉签均匀涂开。③置入药敏纸片、观察抑菌环：使用无菌镊子将不同药敏纸片分别放置于接种Hp后的普通培养基表面的中心位置，培养3 d，后观察有无抑菌环形成，并测量抑菌环直径。抑菌环大小反映中药大黄、黄连、黄芩对Hp的抑制能力。(2)琼脂稀释法：90 μl麦氏浊度为2的菌液分别滴入上述含药培养基中，用棉签将菌液均匀涂开。另用实验菌株(质控菌株)设对照组：90 μl麦氏浊度为2的菌液滴入普通培养基。培养3 d后，观察Hp生长状况，记录能完全抑制Hp生长的培养基中药物的最低浓度，即最小抑菌浓度(MIC)。

联合药敏实验。采用琼脂棋盘稀释法，设计中药大黄、黄连、黄芩不同组合及中药大黄、黄连、黄芩分别与抗生素CLR、LEV、MTZ联合，共12种联合方案的药敏实验。

联合药敏实验所用培养基的制备：根据单药药敏实验得到的药物的MIC，分别制备5种浓度的实验药液备用，使最终含药培养皿中药物的浓度为2MIC、MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC。Karmali固体培养基试剂21.5 g+双蒸水425 ml，121 ℃高压灭菌15 min，待温度降至50 ℃左右，加入脱纤维羊血25 ml、Hp选择性添加剂1瓶，混合均匀后吸取18 ml加入无菌平皿，另加2种上述实验药物的药液各1 ml并混匀。待凝固后倒置冷藏保存。每种联合方案共计制备25种培养基用于联合药敏实验。

联合药敏实验：90 μl麦氏浊度为2的菌液分别滴入含有联合实验药物的培养基上，用棉签将菌液均匀涂开。另设对照组：90 μl麦氏浊度为2的菌液滴入普通培养基。培养3 d后，观察每种联合方案的培养基中Hp生长状况，记录两种药物联合时各自的MIC并计算联合抑菌指数(Fractional inhibitory concentration index,FICI)。FICI=联合用药时甲药MIC/单独用药时甲药MIC+ 联合用药时乙药MIC/单独用药时乙药MIC。FICI≤0.5时甲乙两药为协同作用；0.52时两药为拮抗作用。

2 结果

2.1 三味中药对ATCC43504菌株的抑菌能力 药敏纸片法抑菌环直径及抑菌能力：黄连(22 mm)>大黄(18 mm)>黄芩(10 mm)，对照组培养皿中布满Hp，未见杂菌及抑菌环。琼脂稀释法MIC及抑菌能力：黄连(0.625 mg/ml)>大黄(1.25 mg/ml)>黄芩(5 mg/ml)，对照组培养皿中布满Hp，未见杂菌。

2.2 琼脂稀释法检测抗生素对ATCC菌株的MIC 见表1。

表1 ATCC43504菌株的质控范围、耐药折点及MIC(mg/L)

2.3 联合药敏实验检测各中药间、中药与抗生素联合的抑菌效果 联合用药时，大黄、黄连、黄芩及抗生素CLR、LEV、MTZ的MIC皆较单用时下降(表2，表3)。

三黄泻心汤的组成大黄、黄连、黄芩两两联合用药，有相加作用或协同作用，未见拮抗作用。黄连与黄芩联合，药物敏感性提升较大，药物联合有协同作用(表2)。

大黄、黄连、黄芩分别与抗生素CLR、LEV、MTZ联合用药，有相加作用或协同作用，未见拮抗作用。黄连与CLR、黄连与MTZ、黄芩与MTZ联合，实验药物敏感性提升较大，药物联合有协同作用。菌株ATCC43504为抗生素MTZ的耐药菌株，抗生素MTZ与黄连、黄芩联合用药时，敏感性提升较大，但联合用药时抗生素MTZ的MIC大于耐药折点8 mg/L，菌株依然对抗生素MTZ耐药(表3)。

表2 三味中药间联合用药的MIC及联合抑菌效果

3 讨论

随着对Hp根除的普及，Hp对抗生素(尤其是CLR、MTZ及喹诺酮类)的耐药率在世界范围逐年升高[14]。体外或动物体内实验研究表明，某些中药、中药提取物以及含中药的黏膜保护剂有抑制Hp的作用[9,15-17]，全国多中心随机平行对照的临床研究显示，三联或四联疗法联合中药可以提高Hp根除率，减少三联或四联疗法药物不良反应，对Hp根除失败的患者亦能取得较好的疗效[6,18-21]。有研究表明，中药提取物威迫耐药Hp菌株能提高其对抗生素的敏感性，甚至逆转耐药性使其变为敏感菌株[22]。因此，将传统中药或者中药组方与抗生素联合应用于根除Hp在提升抗生素对菌株敏感度、减轻抗生素带来的不良反应方向的研究成为新的热点。

表3 中药与抗生素联合用药的MIC及联合抑菌效果

有研究对临床根除Hp的核心中药进行归经分析，得出结果：治疗Hp的中药归脾胃二经，以清热解毒、健脾益气为主，清热解毒药类黄连使用较多，健脾益气多使用黄芪[23]。三黄泻心汤出自张仲景的《金匮要略》，由大黄、黄连、黄芩3种中药组成，主要功效为泻火解毒，燥湿泄热除痞。近年体外研究已证实其有抑杀Hp的作用[13]。现代药理研究证明，三味中药有抗炎、体外杀灭Hp作用[24-26]，但关于三味中药间联合对Hp抑制是否存在增敏作用未见报道。本课题组前期在三黄泻心汤组方及其组成成分大黄、黄连、黄芩抑制Hp的临床研究中，证明了三黄泻心汤及其中的三味中药与抗生素联合用于临床，能提高Hp根除率、改善胃不适症状、减轻根除Hp过程中抗生素引起的不良反应[27-28]，但有关三味中药与抗生素联合应用的抑菌效果及是否存在抗菌增敏的体外实验研究尚未见报道。

本实验选用CLSI推荐的ATCC43504质控菌株进行药敏试验，实验过程中抗生素的MIC皆在允许质控范围内，保证了结果的可靠性。通过药敏纸片法及琼脂稀释法皆证实大黄、黄连、黄芩三味中药有抑制Hp作用，抑菌能力从强到弱依次为黄连、大黄、黄芩，在此基础上，采用琼脂稀释棋盘法判断联合抑菌效果。琼脂稀释棋盘法较肉汤稀释棋盘法工作量大、过程繁琐、耗材多[29]，但对于中药的药敏实验不仅能避免中药药液颜色对结果的干扰，而且可以更直观地判断药敏结果。联合用药时，大黄、黄连、黄芩及抗生素CLR、LEV、MTZ的MIC皆较单用时下降。黄连与黄芩、黄连与CLR、黄连与MTZ、黄芩与MTZ联合有协同作用，即两药的联合作用大于单独作用的总和。其余药物组合均为相加作用，即两药的联合作用等于单独作用的总和。Hp菌株ATCC43504为抗生素CLR、LEV的敏感菌株，为抗生素MTZ的耐药菌株，结果表明，中药对菌株ATCC43504有抑制作用，联合用药时，菌株对CLR、LEV、MTZ的敏感性皆有所提升。因此，中药与抗生素CLR、LEV、MTZ联合，可以一定程度上提高抗生素的敏感性；中药联合较单药有更强的抑制Hp能力，而三黄泻心汤组方对Hp的抑制作用可能远远大于三味中药分别单用。

综上所述，三黄泻心汤的组成大黄、黄连、黄芩对Hp有抑制作用，三味中药的联合应用较单药对Hp有更强的抑制作用，中药与抗生素的联合可以进一步提高抗生素抑制Hp的作用。本研究为临床上中药三黄泻心汤辅助抗生素提高Hp的根除率提供了一定的理论依据，为中药辅助根除Hp的研究提供了新的实验数据。