吴门调脂颗粒方对非酒精性脂肪肝大鼠肝组织NF-κBp65/P38MAPK蛋白表达的影响

梁国强，葛惠男，章一凡，欧阳八四，郭金伟，孙 柳，杰 辉，龚 诚，沈贤敏，朱 慧，沈为濂，朱惠萍*

(1.南京中医药大学附属苏州市中医医院，江苏 苏州；2.江苏省名老中医药专家葛惠男传承工作室；3.苏州市吴门医派研究院，江苏 苏州 215009)

非酒精性脂肪肝病(Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是目前全人类的一大顽疾，通常指除酒精原因以外，具有其他明确的损肝因素所致的脂肪过度沉积于肝细胞内为主要特征的临床病理综合征。其易脂肪性病变转归为非酒精性脂肪性肝炎(Non-alcoholic steatohepatitis，NASH)，进一步发展为肝硬化以及肝癌的风险非常大。普通和代谢综合征的人群患病率分别高达6.0%和25.0%[1]。现代中医根据其临床症状认为NAFLD、NASH属于传统中医疾病胁痛、积聚、鼓胀等范畴[2]。当前证实广泛存在于全身多种细胞之中的转录核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)和Kupffer细胞免疫相关信号通路丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)，与NAFLD和NASH发生发展中的炎症、肝纤维化、肝功能衰竭等均存在密切的关系且发挥着重要作用[3]。本研究采用吴门医派已故中医消化内科传人全国名老中医汪达成治疗高脂血症创制的验方“吴门调脂颗粒”方，观察其干预高脂饮食诱导的经典NAFLD大鼠的效应，并探讨对肝组织中NF-κBp65和P38MAPK蛋白调控的初步机制，为该方对NAFLD防治作用的深入研究积累更多的实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康SPF级SD雄性大鼠，体质量(200±20)g，购自苏州昭衍新药研究中心有限公司，许可证号：SCXK(苏)2017-0043。饲养条件：室温(24±2)℃，明暗各半，自由摄食、饮水，适应性饲养7 d用于实验。

1.2 实验药物

吴门调脂颗粒方：水提取物制成的棕黄色浸膏，1g浸膏相当于含量为3.0 g生药，由苏州市吴门医派研究院中心实验室提供(批号：20191003)；多烯磷脂酰胆碱胶囊(易善复)，赛诺菲(北京)制药有限公司产品(批号：F733845)；戊巴比妥钠(Sigma公司生产，批号：20120304)。

1.3 实验试剂

单试剂GPO-PAP法TG、TC测定试剂盒；双试剂直接法HDL-C、LDL-C测定试剂盒；紫外比色法ALT、AST测定试剂盒，均为南京建成生物工程研究所产品；ELISA法GSH、IL-1β、TTNF-α、IL-6测定试剂盒，上海邦奕生物公司产品；苏木素、伊红染色试剂盒，为鸿泉生物科技有限公司产品；NF-κBp65(ab16502，1∶200)、P38MAPK抗体(ab32142，1∶250)，abcam公司产品；广谱二抗，上海长岛生物技术有限公司产品；其他试剂均为市售分析纯。

1.4 实验仪器

Infinite F50酶标仪(瑞士Tecan 公司)；全自动生化分析仪(美国杜邦公司)；HI1210水浴锅(Leica公司)；D5100数码相机(NIKON公司)；CX41正置显微镜(OLYMPUS公司)；恒温烘箱(恒一科学仪器有限公司)；石蜡切片机、摊片机(徕克公司)。

1.5 造模与分组

取53只SD大鼠适应性饲养1周后，分成空白组(n=10)，普通饲料喂养，余43只进行造模，参考文献[4]予以高脂饲料(88%基础饲料+10%猪油+2%胆固醇)喂养，于第8周末随机选取3只大鼠处死，验证造模成功后改普通饲料喂养，并根据体质量随机分为：模型组，西药组(多烯磷脂酰胆碱：80 mg/kg)[5]，中药低、高剂量组(调脂颗粒方：相当于4 g生药/kg、8 g生药/kg，根据人45 g生药/d与大鼠体表面换算等效剂量为低剂量，高剂量放大1倍)[6]4组(n=10)，空白组及模型组同步予以同体积生理盐水，各组以10 mL/kg灌胃给予4W。

1.6 标本制作

各组对应药物干预4周后，末次干预给药1 h后(禁食16 h)，以戊巴比妥钠50 mg/kg腹腔注射麻醉后，腹主动脉采血后分离血清(3 000 r/min，10 min)，-80 ℃冰箱冻存待测相关指标。行安乐处死后，每组随机取5个样本，解剖腹腔，取肝脏组织统一留取右叶，距边缘5 mm，大小约0.5 mm3，多聚甲醛固定，待病理切片观察及免疫组化检测相关指标，残余肝脏组织储存于-80 ℃冰箱备用。

1.7 检测指标及方法

1.7.1 血脂相关指标检测 分别采用单试剂GPO-PAP法和双试剂直接法检测血清TG、TC和HDL-C、LDL-C。

1.7.2 肝酶谱相关指标检测 分别采用紫外比色法和ELISA法检测血清ALT、AST和GSH。

1.7.3 血清炎性相关指标检测 采用ELISA法检测血清IL-1β、TNF-α和IL-6水平。

1.7.4 肝组织病理形态学观察 取各组经甲醛固定的肝组织，采用苏木素、伊红染色试剂盒进行染色观察，光学显微镜下观察肝脏组织形态及脂滴分布状况等。

1.7.5 肝脏NF-κBp65、P38MAPK蛋白表达检测 采用免疫组化法(IHC)检测肝组织NF-κBp65、P38MAPK蛋白的表达，包埋各组大鼠肝组织后切片脱蜡制片。PBS漂洗，再于3%甲醇-H2O2、柠檬酸缓冲液及加热来进行抗原修复。抗原修复后冷却，以血清封闭，室温37 ℃、30 min。按要求加入稀释的一抗置于4 ℃冷库摇床过夜，一抗解育后漂洗，并加入二抗室温37 ℃孵育30 min后加入显色剂，显色并清洗后浸泡于苏木精中2 min，进行复染。复染后按常规脱水方法脱水。脱水后用中性树胶封片晾干。完成的免疫组化片于显微镜下观察、拍摄。

1.8 统计学方法

实验数据运用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，所得数据表示为均值加减标准差，多组间比较采用ANOVA分析，两两比较采用t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组血脂相关指标比较

见表1，与空白组比较，模型组TG有所上升但无统计学差异，TC和LDL-C显著性上升(P<0.001)，HDL-C明显下降(P<0.05)；与模型组比较，给药各组TG明显下降(P<0.05)、HDL-C升高但差异无统计学意义，西药组和中药高剂量组TC、LDL-C显著性下降(P<0.01或P<0.001)，中药低剂量组TC、LDL-C明显下降(P<0.05)。

表1 各组大鼠血清TG、TC和HDL-C、LDL-C水平比较

2.2 各组肝酶谱相关指标比较

见表2，与空白组比较，模型组AST明显升高(P<0.05)、ALT显著性升高(P<0.01)、GSH显著性下降(P<0.001)；与模型组比较，给药各组AST明显下降(P<0.05)，西药组和中药低剂量组ALT明显下降(P<0.05)，中药高剂量组ALT显著性下降(P<0.01)，西药组GSH显著性升高(P<0.001)，中药高剂量组GSH明显升高(P<0.05)，中药低剂量组GSH升高差异无统计学意义。

表2 各组大鼠血清AST、ALT和GSH活性比较

2.3 各组血清炎性相关指标比较

见表3，与空白组比较，模型组IL-1β、TNF-α、IL-6水平均显著性升高(P均<0.001)；与模型组比较，西药组和中药高剂量组给药IL-1β显著性下降(P<0.001或P<0.01)，中药低剂量组IL-1β明显下降(P<0.05)，西药组TNF-α明显下降(P<0.05)，中药低、高剂量组TNF-α下降但差异无统计学意义；西药组IL-6显著性下降(P<0.01)，中药高剂量组IL-6明显下降(P<0.05)，中药低剂量组IL-6下降但差异无统计学意义(P>0.05)。

表3 各组大鼠血清IL-1β、TNF-α、IL-6水平比较

2.4 各组肝组织病理形态学比较

切片显示：空白组大鼠肝组织结构未见明显病变，肝小叶、肝窦结构清晰，多边形的肝细胞排列致密整齐，中央见圆形的细胞核且胞质內无空泡；与空白组比较，模型组大鼠肝组织可见肝小叶结构紊乱，肝细胞膨胀性气球样变，大泡性、小泡性脂滴同时存在于胞质内，胞核被挤压至细胞边缘，可见散在坏死的肝细胞、小叶内炎症浸润等明显的病理性改变。与模型组比较，西药组和中药低、高剂量组肝组织脂肪变性及炎症浸润情况有不同程度的改善；中药高剂量总体改善略有优于低剂量组，脂肪变性改善与西药组相当，但炎症浸润改善不及西药组。见图1。

图1 各组大鼠肝组织病理形态学比较(HE×200)

2.5 各组肝组织NF-κBp65、P38MAPK蛋白表达比较

见图2、表4。每组随机取5个样本进行相关蛋白的IHC进行分析，与空白组比较，模型组大鼠肝组织NF-κBp65显著性上调(P<0.001)、P38MAPK明显上调(P<0.05)；与模型组比较，西药组和中药高剂量组NF-κBp65明显下调(P<0.05)，西药组P38MAPK显著性下调(P<0.01)，中药高剂量组P38MAPK下调但无统计学差异，中药低剂量组NF-κBp65下调、P38MAPK上调但均无统计学差异。中药两组NF-κBp65、P38MAPK蛋白表达仍然显著性高于空白组。

图2 各组大鼠肝组织NF-κBp65、P38MAPK蛋白表达比较(IHC×200)

表4 各组大鼠肝组织NF-κBp65、P38MAPK蛋白表达比较

3 讨论

随着人们生活水平的提高及生活方式的改变，目前我国NAFLD的发病率已接近20.0%，且呈日益升高趋势。其发病机理目前比较认同的为“二次打击学说”，即第一次为高胰岛素血症及胰岛素抵抗(Insulin resistance，IR)导致的单纯肝细胞脂肪变性，第二次为氧化应激及脂质过氧化、炎性细胞因子的释放、线粒体功能障碍而导致的肝细胞炎性反应、滑丝及纤维化，甚至导致肝硬化[7]。虽然随着医患防控意识的不断提高，提倡饮食上少吃高脂高糖、提高有氧运动以及戒烟、戒酒和保持良好生活作息习惯等，但是由于现代社会生活节奏快、工作压力等因素，关键的问题是“持之以恒”很难做到。西医治疗主要从胰岛素增敏剂、抗氧化剂、改善脂代谢、肝细胞保护剂等几个方面，虽然效果“立竿见影”，但也伴随着损伤肝细胞以及反复发作的风险，而且大多数药物价格昂贵，目前尚未出现特效药[8]。随着中医药的深入研究和发展，发现中医药治疗 NAFLD 具有一定的疗效和优势，临床准确辨证施药是关键，体现出副作用少、疗效稳定，尤其适用于慢性患者长期服用[9，10]。

吴门调脂颗粒方的创制依据吴门医派倡导的络病学术思想“经年宿疾，病必在络”的中医理论，组方为：蒲黄、姜黄、泽泻和莱菔子。NAFLD虽发病于微，但病变时间长，其主要病理基础以痰、瘀痹阻脉络为主。其中蒲黄甘、平，归肝、心包经，具有活血化瘀通络为君药；姜黄辛、苦、温，归肝、脾经，行气活血、痛经止痛，泽泻甘、淡、寒，归肾、膀胱经，具有利水渗湿泻热，通肾之开合，两者为臣药；再佐以辛、甘、平，归脾、胃、肺经的莱菔子，发挥其消食除胀、降气化痰的作用。四药共同体现化痰祛瘀通络的疗效，在多年的临床治疗NAFLD等疾病的实践中每获良效[11-15]。在前期的实验研究中初步亦表明了吴门调脂颗粒方具有对NAFLD小鼠加速对脂质的转运和代谢，抑制慢性炎症、调控细胞过度自噬等，保护肝脏的作用[16-19]。

基于以上基础，本研究中以经典NAFLD大鼠模型为工具，经吴门调脂颗粒方干预后发现，血脂相关指标、肝酶谱相关指标和血清炎症因子相关指标以及病理形态学分析结果表明：吴门调脂颗粒方高剂量干预可明显改善NAFLD大鼠的指征和病理特征，这些结果都与吴门调脂颗粒方临床疗效和前期实验基础类同。MAPKs是哺乳动物细胞内广泛存在的一类丝/苏氨酸蛋白激酶，参与细胞增殖、分化、转化及凋亡的调节，并与炎症、肿瘤及其他多种疾病的发生发展密切相关，而p38MAPK是MAPKs家族控制炎症反应主要成员，其参与NF-κB、TNF-α等众多炎症因子的调控，并与这些炎症因子形成正反馈调节作用[20-21]。本次实验结果显示：吴门调脂颗粒方高剂量具有下调和上调脂肪肝组织P38MAPK和NF-κBp65蛋白表达作用。

综上所述，本实验通过高脂饲料诱导的方法成功制备NAFLD大鼠模型，且病变肝组织中NF-κBp65和p38MAPK蛋白表达较正常组显著上调表达，在吴门调脂颗粒方的干预下，血脂、肝酶谱和炎症相关指标得到调控性改善，病理学改变减轻，显著降低了NF-κBp65蛋白的表达，但对p38MAPK蛋白过表达影响相对较弱。提示吴门调脂颗粒方通过化痰祛瘀通络功用抑制NAFLD引起的肝脏脂质沉积，推断其主要与调控肝组织中NF-κBp65过表达存在一定关系。在进一步研究中，应该借鉴代谢组学、生物信息学分析以及构建目标蛋白病毒等现代科学技术，对吴门调脂颗粒方干预炎症因子、氧化应激因子所介导的NF-κB/MAPK通路的整体效应进行系统性研究，多维多息地表征中医药治疗NAFLD的疗效机制。