晋产小叶黑柴胡药材质量标准研究

张 妤，蔡翠芳，高晓霞

(1.山西药科职业学院，山西 太原 030031； 2.山西大学 中医药现代研究中心，山西 太原 030006)

小叶黑柴胡BupleurumsmithiiWolff var.parvifoliumShan et Y.Li为伞形科柴胡属植物，生长于海拔2 700～3 700 m的山坡草地，产于我国山西、甘肃、宁夏等地[1]。小叶黑柴胡药用部位为干燥的根，味苦，性微寒，具有疏散退热、疏肝、升阳之功[2-3]，其含有20多种皂苷、30多种挥发油，以及木脂素等成分[4-7]，具有解热、抗炎、镇痛、抗肝损伤、抗肝纤维化等药理活性[7-11]。小叶黑柴胡药材作为柴胡的地方习用品，有较长的用药历史[2，3，7]，主要产自山西省宁武、五寨、神池等地[12]。小叶黑柴胡于1987 年作为地方习用中药载入《山西省中药材标准》[2]，目前该标准仅对该药材的性状、炮制方法、性味、功能主治、用法用量作了简单陈述，并不能对药材质量进行有效控制。因此，本课题通过对收集自晋北地区的6个批次小叶黑柴胡药材进行性状、显微鉴别、薄层色谱鉴别、一般检查项(水分、总灰分、酸不溶灰分)、醇溶性浸出物等项目的研究，旨在为该药材质量标准的提升及完善提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

1.1.1 仪器 MS-204s十万分之一电子分析天平(METTLER TOLEDO)；SX2.5-10型高温箱式电阻炉(北京科伟永兴仪器有限公司)；DHG-9075A型鼓风干燥箱(上海一恒科技有限公司)；LC-350A超声清洗器(济宁鲁超仪器厂)；HH-2型数显恒温水浴锅(金坛市科析仪器有限公司)；WHF-203 型三用紫外分析仪(上海精科实业有限公司)；YD-1508B 型轮转式石蜡切片机(浙江金华益迪医疗设备厂)；生物显微镜(麦克奥迪实业集团有限公司)；QE-100 g型二两装高速中药粉碎机(武汉市屹立工具有限公司)等仪器。

1.1.2 试药 硅胶板GF254(银龙牌，烟台市化工研究所，批号：20191031)；甲醇(国药集团化学试剂有限公司，分析纯)、乙醇(国药集团化学试剂有限公司，分析纯)、二甲氨基苯甲醛(国药集团化学试剂有限公司，分析纯)、硫酸(国药集团化学试剂有限公司，分析纯)、二甲苯(国药集团化学试剂有限公司，分析纯)、乙酸(国药集团化学试剂有限公司，分析纯)、乙酸乙酯(国药集团化学试剂有限公司，分析纯)；双蒸水(自制)。柴胡皂苷a及柴胡皂苷d对照品(批号：110777-201711、110778-201711，中国食品药品检定研究院)。小叶黑柴胡药材共6批次：S1，神池县西沟，采集日期：2020-07-09；S2，岢岚县神塘坪，采集日期：2020-08-19；S3，五寨县马家坪，采集日期：2020-07-14；S4，宁武县牛家岭，采集日期：2020-07-11；S5，宁武县寺耳沟，采集日期：2020-07-12；S6，神池县大泉窊，采集日期：2020-07-10。经山西药科职业学院蔡翠芳教授鉴定为伞形科植物小叶黑柴胡BupleurumsmithiiWolff var.parvifoliumShan et Y.Li的干燥根。

1.2 试验方法

1.2.1 性状鉴别 使用标尺测量小叶黑柴胡根的大小。采用眼看、手摸、鼻闻、口尝等性状鉴定的方法直观地对各批次样品形状、表面特征、质地、断面及气味等进行鉴别。

1.2.2 显微鉴别 在小叶黑柴胡根的上部、中部、下部分别切取厚度约1 mm的薄片置载玻片上，滴加蒸馏水(必要时，加热透化)，盖上盖玻片，置显微镜下对各批次样品进行观察、测量与拍照。

1.2.3 薄层色谱鉴别 取上述6批小叶黑柴胡根及其根茎分别粉碎，各取0.5 g，分别加甲醇20 mL，使用超声清洗器超声(200 W，40 kHz)10 min后，将滤液浓缩(5 mL)制成供试品溶液。另取柴胡皂苷a、柴胡皂苷d对照品，加甲醇制成每1 mL各含0.5 mg的对照品溶液。再取对照药材柴胡0.5 g，同法制成对照药材溶液。参照《中国药典》薄层色谱法(通则0502)[13]试验，分别吸取5 μL供试品溶液、对照药材溶液与对照品溶液，并点于硅胶G薄层板上，展开剂乙酸乙酯-乙醇-水(8∶2∶1)，展开后取出。晾干喷以2%对二甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液，放置于紫外光灯(365 nm)下检视。

1.2.4 一般检查项 选取晋北6个地区收集的小叶黑柴胡原药材样品，粉碎过2号筛，备用，每个批次平行测定3次。水分，按照《中国药典》(2015年版四部附录 Ⅸ)[13]中水分测定法项下第二法(烘干法)进行测定。总灰分，按照《中国药典》(2015年版四部附录 Ⅸ)[13]灰分测定法项下进行测定。酸不溶性灰分，按照《中国药典》(2015年版四部附录 Ⅸ)[13]总灰分测定法项下酸不溶性灰分测定。

1.2.5 醇溶性浸出物 选取晋北6个地区收集的小叶黑柴胡原药材，粉碎过2号筛，备用，每个批次平行测定3次。照《中国药典》(2015年版四部附录 Ⅸ)[13]醇溶性浸出物测定法项下的热浸法(通则2201)测定，用乙醇作溶剂。

1.3 统计方法

数据统计分析采用SPSS 13.0 统计软件进行描述性统计，并计算标准差与变异系数。

2 结果与分析

2.1 性状特征

通过对晋产6批小叶黑柴胡药材进行性状鉴别观察，其性状鉴别特征(见图1)：

根呈长圆锥形或圆柱形，多分枝，长度多5～10 cm，直径0.2～0.8 cm。顶端有残茎2～10个，部分排列在一个平面。根上部近圆形，有稀疏的不定芽，有时排成两列，长0.2～0.4 cm。表面黑褐色或浅棕色，具突起的支根痕。质硬而略韧，易折断；断面纤维性，皮部浅棕色，多有裂隙，木部黄白色，有放射状纹理。气微香，味微苦。

2.2 显微鉴别

通过对6批小叶黑柴胡原药材根上部、中部、下部横切面进行显微观察发现，该药材的显微特征为：木栓层为10～50余列扁平细胞组成；韧皮部外侧油室细胞8～12个，内含黄色油状物。韧皮部油室较多，排列成2～6层，内含黄色油状物；形成层成环或不明显。木质部束放射状排列，导管束间常见裂隙。见图2。

注：1.木栓层；2.皮层；3.韧皮部；4.木质部

2.3 薄层色谱鉴别

按照“1.2.3 薄层色谱鉴别”项下的方法对小叶黑柴胡样品的根及其根茎分别进行测定(见图3)。6批小叶黑柴胡样品的薄层色谱基本一致，各条带无明显差异。在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点或荧光斑点，且与对照药材北柴胡薄层色谱存在显著差异。此外，6批小叶黑柴胡的根茎薄层色谱基本一致，在小叶黑柴胡样品及对照药材色谱相应的位置上，斑点或荧光斑点颜色较淡。因此，本方法可有效鉴别小叶黑柴胡。

注：2、4、7、9、13、14为样品的根；1、3、6、8、11、12为样品的根茎；5为柴胡皂苷a；10为柴胡皂苷d；15为北柴胡对照药材。

2.4 一般检查项

水分：根据减少的重量，计算供试品中含水量(%)，6批药材水分含量为6.46%～7.40%(见表1)，其中最高值为7.40%，最低值为6.46%，二者相差0.94%。经统计分析，6批药材水分含量的平均值为(6.99±0.39)%，变异系数为5.58%。通常认为变异系数在100%以上为强变异，变异系数在10%～100%为中等变异，变异系数在0～10%为弱变异。供试药材样品水分含量为弱变异，因此暂定药材水分不得超过9.0%(按平均水分含量1.3倍量计算取整)为标准。

总灰分：对6批小叶黑柴胡灰化后所得残渣进行称定，以其质量为依据，计算药材总灰分含量。6批样品总灰分为5.22%～7.84%(见表1)，其中，最高值为7.84%，最低值为5.22%，二者相差2.62%。经统计分析，6批药材总灰分含量的平均值为(6.47±1.07)%，变异系数为16.54%。供试药材样品总灰分含量为中等变异，因此暂定药材中总灰分含量不得超过9.0%(按平均总灰分含量1.4倍量计算取整)为标准。

酸不溶性灰分：对6批小叶黑柴胡酸溶后的残渣进行称定，以其质量为依据，计算药材酸不溶性灰分的含量。6批样品酸不溶性灰分含量为1.13%～2.12%(见表1)，其中，最高值为2.12%，最低值为1.13%，二者相差0.99%。经统计分析，6批药材酸不溶性灰分含量平均值为(1.68±0.44)%，变异系数为26.19%。供试药材样品酸不溶性灰分含量是中等变异，因此暂定药材中酸不溶性灰分含量不得超过2.40%(按平均酸不溶性灰分含量1.4倍量计算取整)为标准。

2.5 醇溶性浸出物

依照记录的质量，计算对应浸出物质量百分比，即供试品中浸出物的含量(%)。6个样品的醇溶性浸出物含量为22.98%～28.60%(见表1)。其中，最高值为28.60%，最低值为22.98%，二者相差5.62%，经统计分析，6批药材醇溶性浸出物含量平均值为(25.93±2.09)%，变异系数为8.06%。供试药材样品醇溶性浸出物含量是弱变异，因此暂定药材中醇溶性浸出物含量不得低于18.0%(按平均浸出物含量的0.7倍量计算取整)为标准。

表1 小叶黑柴胡药材水分、总灰分、酸不溶性灰分、醇溶性浸出物含量测定结果

3 讨论与结论

柴胡属植物在中国已有几百年的药用历史，由于各地环境差异，导致品种不尽相同，人们根据历史使用习惯自产自销。因此，柴胡属药材来源复杂，市场销售混乱，混淆品较多[14]。而药材基原确定是制定质量标准的第一步，本课题中的6批次小叶黑柴胡试验样品均为实地采集，且同时采集原植株标本，保证了研究的准确性。此外，2批次采于宁武县，2批次采于神池，1 批次采于五寨，1 批次采于岢岚，基本覆盖山西省小叶黑柴胡的主要产区，样品也具有一定的广泛性和代表性。

利用性状鉴定来鉴别药材简单、易行且迅速[15]，本课题对收集的所有小叶黑柴胡原药材样本进行了鉴别观察，并总结归纳了小叶黑柴胡原药材性状鉴别的特征，涵盖了根外形、支根数量、表面色泽、残留茎基、质地及气味等柴胡性状差异特征，满足了药材流通领域基本鉴别的需求。显微鉴定是中药鉴定的重要手段之一，利用药材的组织构造、细胞形状特征，达到鉴定药材真伪的目的[16]，本课题建立的小叶黑柴胡的横切面中木栓细胞、韧皮部油管、木化纤维群、大口径导管等特征也可作为小叶黑柴胡生药鉴别的重要参考，这些特征也可能与药材品质存在一定的联系[17]。薄层色谱在植物药成分的定性与定量分析中应用非常广泛，可快速有效判断样品中的成分及含量[16]。2015 版《中国药典》规定柴胡药材的薄层鉴别以柴胡皂苷 a、d 为指标，然而柴胡类药材基本都含有柴胡皂苷 a、d[18]，但薄层色谱图能直观表现出柴胡类药材皂苷成分的异同及含量差异。图3显示，小叶黑柴胡的薄层色谱图基本稳定一致，与对照药材柴胡的色谱区别明显，与小叶黑柴胡根茎一致的薄层色谱也有明显差异。因此，以柴胡皂苷 a、d 为参照，对比小叶黑柴胡皂苷的含量，可作为比较小叶黑柴胡薄层鉴别的依据之一。

水分、灰分、酸不溶性灰分及浸出物是影响小叶黑柴胡品质的重要指标，这些指标对于小叶黑柴胡药效的发挥至关重要。中药材的含水量与其质量关系密切，尤其是在中药材的生产、加工、储运及使用过程中，对质量变化起主导作用[19]。本课题中小叶黑柴胡药材的水分含量在6.46%～7.40%，且变异系数较低，属于弱变异，故建议水分标准按平均含水量的1.3倍量计算。总灰分指药材经高温炽灼灰化后残留的无机物，由药材自身含有的无机成分及外来杂质组成，而外来杂质多为药材在生长、加工与运输中粘带的泥土、砂石等无机杂质，是酸不溶性灰分的主要成分，在一定程度上会影响药材质量[20]。本课题中小叶黑柴胡药材的总灰分含量为5.22%～7.84%，酸不溶性灰分含量为1.13%～2.12%，变异系数较高，属于中等变异，故建议总灰分及酸不溶性灰分标准按平均含水量的1.4倍量计算。浸出物是评价中药材质量的重要功能性指标，是复杂中药成分的整体反映[16]，本课题中小叶黑柴胡药材的醇溶性浸出物含量为22.98%～28.60%，变异系数较低，属于弱变异，故建议乙醇浸出物标准按平均醇溶性浸出物含量的0.7倍量计算。

本课题采用多重指标控制为小叶黑柴胡药材的质量研究提供了合理依据，由于目前对小叶黑柴胡相关质量标准的报道较少，本课题建立的性状、显微、薄层色谱，以及水分≤9.0%、总灰分≤9.0%、酸不溶灰分≤2.40%、醇溶性浸出物≥18.0%等标准可推荐暂定为该药材的建议标准，既可用于评价晋产小叶黑柴胡药材的质量，也为其临床用药安全、可控提供了科学依据。