外感风痧颗粒HPLC指纹图谱研究

刘 云，覃洁萍，刘 雯*，周丽园

(1.徐州医科大学附属医院，江苏 徐州 221002；2.广西中医药大学 药学院，广西 南宁 530001)

外感风痧颗粒为国家颁布标准品种、广西传统特色优势壮药，是广西中医药大学百年乐制药厂特色品种。外感风痧颗粒由苍耳草、岗梅、狗仔花、山芝麻、藤苦参、两面针六味药材配方而成，具有清热、祛风的功效，可用于咽喉肿痛、风热感冒等症，疗效显著[1]。药理研究表明外感风痧颗粒具有明显的抗菌、退热、镇痛、抗炎、增强免疫功能等作用，且毒副作用低，具有很大的临床应用潜力[2-3]。长期临床试验和药理试验证明外感风痧颗粒按临床拟用的剂量、途径及疗程使用安全有效[4-5]。通过查阅相关文献，对组方中各药材的成分进行分析，发现苍耳草药材的重要活性成分为酚酸类、蒽醌和黄酮类成分[6-8]；岗梅药材中含三萜皂苷类、木脂素类、酚酸成分[9-11]；狗仔花中含有苯丙素类、甾体类、脂肪醇类、脂肪酸类成分[12-13]；山芝麻中含有三帖类、萘醌类、山芝麻醌类成分[14-15]；藤苦参中含强心苷类、生物碱类、萜类和酚酸类成分[15-16]；两面针含有生物碱类、木脂素类、黄酮类、三萜类和酰胺类成分[17-18]。目前已有学者对外感风痧颗粒的薄层鉴别和含量测定进行研究[19]。本课题组先后建立了HPLC同时测定外感风痧颗粒中4种组分[20]及9种组分的方法，本论文在前期研究的基础上建立了外感风痧颗粒的高效液相色谱指纹图谱，为完善外感风痧颗粒的质量标准提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

e2695高效液相色谱仪(美国沃特世公司)；UPC-Ⅱ-10T纯水仪(四川优普超纯科技有限公司)；KQ5200B超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；TGL-16B高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；PRACTUM224-1CN万分之一电子分析天平(塞多利斯科学仪器有限公司)。

1.2 材料

新绿原酸标准品(批号6630)，绿原酸标准品(批号6361)，隐绿原酸标准品(批号3208)，均购于上海诗丹德标准技术服务有限公司，纯度≥98.0%。咖啡酸标准品(批号RP190614)，异槲皮苷标准品(批号RP190404)，异绿原酸A标准品(RP180903)，异绿原酸B标准品(批号RP180514)，异绿原酸C标准品(批号RP180704)，均购于成都麦德生科技有限公司，纯度≥98.0%。乙腈为色谱纯，其余均为分析纯。

外感风痧颗粒10个批次均产自广西中医药大学百年乐制药厂，批号分别为：20180101、20180402、20180403、20190302、20190303、20190401、20180304、20180401、20190301、20191001。

2 方法与结果

2.1 外感风痧颗粒供试品溶液的制备

精密称取外感风痧颗粒粉末(20190303)约10.0 g，置具塞磨口锥形瓶中，精密量取25 mL甲醇加入具塞磨口锥形瓶中，精密称定并记录重量，超声40 min，放凉，再称定重量，并用甲醇补足减失的重量，摇匀，静置，将上清液用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2 对照品溶液制备

分别精密称取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异槲皮苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C对照品各约3 mg，置于8个2 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，即得对照品储备液。各取对照品储备液适量置于同一2 mL容量瓶中，加甲醇定容至2 mL，摇匀，即得。

2.3 色谱条件

色谱柱：依利特Hypersil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；乙腈-0.2%磷酸系统梯度洗脱，程序见表1；检测波长330 nm；流速0.8 mL/min；柱温35 ℃。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 精密称取外感风痧颗粒粉末(20190303)约10.0 g，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进样分析，连续进样6次。记录图谱14个共有峰的保留时间和峰面积。以5号峰作为参照峰(S)，计算14个共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果外感风痧颗粒各色谱峰的相对保留时间RSD<1.3%，各峰相对峰面积RSD<2.3%，说明仪器精密度良好。

表1 梯度洗脱程序

2.4.2 稳定性试验 精密称取外感风痧颗粒粉末(20190303)约10.0 g，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，按2.3项下色谱条件，分别在放置0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h后进样分析。以5号色谱峰为参照峰(S)，计算14个共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果外感风痧颗粒各色谱峰的相对保留时间RSD<1.8%，各峰相对峰面积RSD<3.0%，表明该方法制得的外感风痧颗粒供试品溶液在室温24 h内稳定性良好。

2.4.3 重复性试验 精密称取外感风痧颗粒粉末(20190303)约10.0 g，平行6份，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进样分析，以5号峰作为参照峰(S)，计算14个共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果外感风痧颗粒各色谱峰的相对保留时间RSD<0.1%，各峰相对峰面积RSD<2.8%，表明本实验所建立的方法重复性良好。

2.5 指纹图谱的建立

取10批外感风痧颗粒样品，按“2.1”项下的方法制备供试品溶液，按“2.3”项下的色谱条件进样分析，记录色谱图。将10个色谱图分别导入中药色谱指纹图谱相似度评价(V2012)软件，以S5号样品的色谱图为参照，采用中位数相关系数法，设定时间窗为0.1 min，对色谱峰进行多点校正和匹配，建立外感风痧颗粒的指纹图谱，从中选择了14个色谱峰作为外感风痧颗粒的共有峰，结果见图1。选择色谱峰形及分离度良好的5号峰作为参照峰，计算14个共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见表2、表3。

取对照品溶液，按“2.3”项下色谱条件进样，得到混合对照品溶液色谱图。结合紫外光谱信息和混合对照品色谱图并查阅相关文献，初步指认出外感风痧颗粒指纹图谱中8个共有峰，分别为新绿原酸(4号峰)、绿原酸(5号峰)、隐绿原酸(6号峰)、咖啡酸(7号峰)、异槲皮苷(9号峰)、异绿原酸B(10号峰)、异绿原酸A(11号峰)、异绿原酸C(12号峰)，结果见图2、图3。

2.6 相似度评价

将10批外感风痧颗粒的色谱分别导入中药色谱指纹图谱相似度评价(V2012)软件进行相似度评价，结果其相似度均大于0.9，见表4。结果表明不同批号的外感风痧颗粒具有良好的相似性。

图1 10批外感风痧颗粒HPLC叠加图

表2 10批外感风痧颗粒14个共有峰相对保留时间

表3 10批外感风痧颗粒指纹图谱共有峰的相对峰面积

图2 外感风痧颗粒指纹图谱的对照图谱(R)

图3 混合对照品溶液的HPLC色谱

表4 外感风痧颗粒HPLC色谱相似度评价结果

3 讨论

本实验分别考察了回流提取和超声提取2种提取方法，考察了提取溶剂、提取时间、料液比，根据色谱图的信息量和色谱峰峰面积，最终样品提取方法确定为：10 g样品加25 mL甲醇超声40 min。

本实验对液相条件进行了优化，分别考察了流动相系统、柱温、流速、检测波长，以色谱信息量、色谱峰形、峰面积以及相邻色谱峰的分离度等为指标，最终确定液相色谱条件为：乙腈-0.2%磷酸系统梯度洗脱，柱温35 ℃，流速0.8 mL/min，检测波长330 nm。

4 结论

本文建立了外感风痧颗粒HPLC指纹图谱，提取了14个共有峰。文中指认了8个共有峰，分别为新绿原酸(4号峰)、绿原酸(5号峰)、隐绿原酸(6号峰)、咖啡酸(7号峰)、异槲皮苷(9号峰)、异绿原酸B(10号峰)、异绿原酸A(11号峰)、异绿原酸C(12号峰)。由相似度评价结果可知，10批外感风痧颗粒相似度均大于0.9，说明制备工艺合理稳定。本实验所建立的外感风痧颗粒HPLC指纹图谱分析方法简单方便、重复性好，可对外感风痧颗粒进行质量控制，为外感风痧颗粒质量标准的建立和完善提供了一定的科学依据。