甘露消毒丹中芳香药物防治流感的作用机制探讨
——基于网络药理学

侯宏彬，刘光华，吴振起，任园园，汤玉梅，钟润锋

(1.辽宁中医药大学 研究生院，辽宁 沈阳 110847；2.辽宁中医药大学 中医学院，辽宁 沈阳 110847；3.辽宁中医药大学附属医院 儿科，辽宁 沈阳 110032)

流感即流行性感冒是流感病毒引起的一种常见的呼吸道传染性疾病。近年来爆发流行的H5N1禽流感病毒、H9N2禽流感病毒、甲型H1N1禽流感病毒都表现出发病时间短、传变速度快、易造成广泛流行的特点，流感病毒易突变的特性也使疫苗与相关药物的研制滞后，因而其流行变得更加频繁，严重威胁人们的健康。

甘露消毒丹是中医学中运用芳香药物治疗流感的代表方剂，首见于叶天士的《医效秘传》，甘露消毒丹中的芳香药物有石菖蒲、广藿香、薄荷、蔻仁、茵陈，具有芳香辟秽、开窍化浊、宣肺通络、醒脾和胃之效。

1 资料与方法

1.1 获取芳香中药的化学成分

通过Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP)网站查询获得上述芳香药物的化学成分。

1.2 筛选药物的有效成分

根据口服生物利用度(OB)≥30%，药物相似性(DL)≥0.18的标准筛选药物的有效成分[1]。

1.3 获取上述芳香药物的有效成分及靶点信息与流感的靶点并预测潜在的作用靶点

采用TCMSP平台获取上述芳香药物的有效成分及靶点信息并加以分析整理。在GeneCard数据库中输入“influenza”并检索，获得与流感相关的靶点，并根据相关性得分筛选，保留得分大于1.5的流感潜在的作用靶点[2]。在Draw Venn Diagram网站将上述芳香药物的有效成分靶点与流感潜在的作用靶点在线绘制成Venn图，通过绘制Venn图获得交集靶点。两者的交集靶点即为上述芳香药物治疗流感的潜在靶点。

1.4 构建蛋白质相互作用(PPI)网络图

在STRING数据库导入上述交集靶点，将蛋白质数据库种类限定为智人，其他项目保留默认设置，绘制PPI网络图，将靶点间相互关系的数据结果以TSV文件格式保存，并应用Cytoscape3.7.2软件中的“Network Analysis”功能加以分析。根据度值及介数值对节点进行筛选，将两个参数都高于平均值的靶点选为关键靶点。将关键靶点导入STRING数据库构建PPI网络。

1.5 绘制“中药-有效成分-关键靶点”图

利用Cytoscape3.7.2软件将中药名、有效成分及其潜在的作用靶点绘制成“中药-有效成分-作用靶点”网络图。在网络中，Degree值越大，则与该节点相关的节点越多。图中的图形大小与Degree值成正相关。

1.6 对关键靶点进行基因本体(GO)及基因组百科全书(KEGG)富集分析

在Metascape数据库输入关键靶基因，物种选择为智人，对关键靶基因进行GO 富集分析与KEGG富集分析，分析关键靶点参与的生物学过程、细胞结构、分子功能及信号通路，并输出结果。利用微生信网站(http：//www.bioinformatics.com.cn/)绘制相应的富集气泡图。

2 结果

2.1 药物有效成分

在TCMSP数据库中检索获得上述芳香药物的成分共487个。根据OB≥30%、DL≥0.18对成分进行筛选，剔除无效成分，共得到47个有效成分。将中药及关键有效成分导入Cytoscape3.7.2软件，采用网络拓扑分析，通过介数中心排列，获得其中最高的3种有效成分，分别为槲皮素(MOL000098，quercetin)、芫花素(MOL005573，Genkwanin)及木犀草素(MOL000006，luteolin)。

2.2 构建药物-疾病靶点Venn图

在TCMSP 数据库中检索上述芳香药物中化学成分的作用靶点，除去重复的靶点，共获得224个药物有效作用靶点。在 GeneCards数据库检索流感相关作用靶点，并根据相关性得分对其进行筛选，得到作用靶点1 326个。对有效药物作用靶点及流感相关作用靶点进行Venn分析，得出上述芳香药物作用于流感的相关作用靶点78个。见图1。

图1 Venn图

2.3 PPI网络构建

将78个相关作用靶点导入STRING数据库，建立靶点PPI网络。在网络中靶点间的相互作用关系由1 395条连线表示，线条越粗表示具有越强的相互作用，结果以TSV格式保存。

2.4 关键靶点筛选

在Cytoscape 3.7.2软件中导入上述TSV格式文件，对网络进行拓扑属性的分析，度值的平均值为35.77，介数的平均值为7.23×10-3，筛出度值、介数值均高于平均值的靶点共24个。将筛选获得的关键靶点导入STRING数据库构建PPI网络图(见图2)。网络中连接其他靶点较多的节点起关键作用。将甘露消毒丹中的芳香药物及其含有的有效成分及24个关键靶点导入Cytoscape3.7.2软件构建成“中药-有效成分-关键靶点”交互作用网络图(见图3)。图3显示出多个中药作用于一个靶点、一个化学成分作用于多个靶点、多个中药成分作用于一个靶点等特征，这表明甘露消毒丹中的芳香药物是通过多成分、多靶点协同的作用达到防治流感的效果。

2.5 GO富集与KEGG通路富集分析

在Metascape数据库输入24个关键靶点，对其采取GO富集分析与KEGG富集分析。GO富集分析共获得GO Biological Processes条目967条，GO Cellular Components条目28条，GO Molecular Functions条目46条，根据P<0.05，选取每种条目的前10条建立富集分析条形图(见图4)。KEGG富集分析共获得相关分子通路114条，根据P<0.05，选取前20条的相关分子通路构建富集气泡图(见图5)。

图3 “中药-有效成分-关键靶点”相互作用网络

图4 GO 富集条形图

图5 KEGG通路富集气泡图

3 讨论

本课题得出甘露消毒丹中芳香药物的有效化学成分45种，其中，槲皮素、芫花素、木犀草素最为关键。研究[3]发现，槲皮素能减少甲型H1N1病毒感染后Caspase-3蛋白的表达，从而减少细胞凋亡作用。实验研究[3-4]表明，槲皮素能有效抑制流感病毒在呼吸系统的复制，降低肺部炎症水平，提高巨噬细胞的吞噬能力，缓解血清中的炎症状态。芫花素具有抗炎作用及镇痛作用[5]，能缓解流感的炎症表现及周身酸痛的症状。木犀草素是一种天然类黄酮，具有调节免疫、抑制氧化、抗炎、抗病毒等多种功效，能通过调节TLR信号通路及凋亡相关因子的表达起到抗炎与抗流感病毒的作用，并能通过抑制细胞凋亡减少病毒的免疫损伤[6]。

对药物与疾病的交集靶点进行筛选后共获得关键靶点24个，涉及的靶点主要与流感病毒的感染、复制，以及炎症反应的激活与调节有关。其中，IL-6、IL-8、TNF是流感病毒感染过程中单核细胞与巨噬细胞被激活产生的重要细胞因子，其功能主要是介导炎症反应，造成炎症损伤[7]。IL-6、TNF-α是重要的炎症因子，能介导中性粒细胞中CD11b/CD18、CD11c/CD18表达水平的提高，并促进白细胞的炎症渗出，还能作为内源性致热源，作用于体温调节中枢，从而引起发热[8]。IL-10可通过减少促炎因子的释放，减少过度炎症反应造成的损伤[7]。IL1B的遗传变异可能与流感的易感性相关[9]。CCL2是H7N9禽流感病毒感染后可介导包括急性呼吸窘迫综合征(ARDS)在内的急性肺损伤的重要蛋白[10]。CXCL8、IL-8在肺上皮细胞感染病毒后释放，可能有利于吸引中性粒细胞以迅速清除坏死碎片，从而防止细菌感染发生[11]。表皮生长因子(EGFR)在IAV进入过程中不可或缺[12]。EGFR的下游信号可介导凝血途径及肺B细胞下调，与高致病性流感感染的严重程度有关[13]。STAT1是流感病毒的早期复制及炎症反应中的重要蛋白，并参与了病毒vRNA的合成[14]。JUN是编码c-jun的基因[15]，c-jun可被JNK磷酸化，并与c-fos构成二聚体，即AP-1。转录因子活化蛋白-1 (Transcription factor AP-1)的表达可参与调节IL-6、IFN、ICAM1等多种细胞因子及炎症介质的表达，在流感病毒感染早期有促进病毒感染及复制的作用[15-16]。Caspase-3 则是介导细胞调亡的关键蛋白[3]。

通过GO富集分析发现，上述芳香药物治疗流感的基因功能主要涉及对氧化应激的反应、对活性氧的反应、对无机物质的反应、对脂多糖的反应、对细菌来源分子的反应等生物学过程，膜筏、膜微区、膜区、囊泡腔、小窝、质膜筏等细胞结构，以及细胞因子受体结合、细胞因子活性、受体调节剂活性、核心启动子结合、肿瘤坏死因子受体超家族结合等分子功能。这些生物学过程及分子功能多数与病原体引起的免疫反应及其介导的炎症因子风暴关系密切。由KEGG通路富集分析得出，甘露消毒丹中芳香药物治疗流感的重要通路有IL-17信号通路、TNF信号通路、Toll样受体信号通路、NOD样受体信号通路、MAPK信号通路、癌症通路等，主要与病毒的感染、复制，以及炎症反应的激活有关。其中，IL-17是一种由Th17细胞分泌的强炎症因子，可介导多种炎症因子及趋化因子的活化，并能通过促进肿瘤坏死因子的产生介导呼吸道平滑肌细胞分泌IL-6，激活中性粒细胞并使其成熟[17-18]。IL-17在炎症细胞的组织浸润及诱导肺部损伤中起重要作用[17]。流感病毒入侵呼吸道上皮细胞后介导促炎因子TNF-α的分泌，从而使IL-6的分泌也随之增加，二者被认为是炎症因子风暴中的关键节点[19]。TNF-α的增多可介导白细胞迁移、激活肺内皮细胞，并使粒细胞脱颗粒。IL-6可导致中性粒细胞与巨噬细胞增殖，介导更多炎症因子产生，加重炎症反应[19]。TLRs是一种最早发现的PRRs，可识别多种不同的病原体相关分子模式(Pathogen assciated molecular patterms，PAMPs)。肺内的巨噬细胞通过TLRs介导流感病毒ssDNA的识别，进而激活相关的抗病毒机制及免疫应答[20]。TLRs识别PAMPs后诱导Toll/白细胞介素1受体活化，并与髓样分化因子(Myeloid differentiation factor88，MyD88)发生相互作用。MyD88能吸引白介素相关激酶4(Interleukin-1 receptor-associated kinase 4，IRAK-4)，与TLRs共同作用，诱导IRAK-1的活化，进而激活肿瘤坏死因子相关因子6(TNF receptor associated factor 6，TRAF6)，并进一步导致IκB激酶与NF-κB活化[21]。被激活的下游转录因子与信号分子可介导微生物分子、细胞因子、趋化因子、共刺激分子的产生[21]。NOD样受体(NODs)是一类主要存在于细胞胞浆中的重要PRRs，其中，NLR蛋白3是一种与病毒感染相关，且被深入研究的NOD样受体。NLRP3炎症小体是一种由NLRP3蛋白、ASC蛋白及Caspase-1前体构成的蛋白质复合体，能诱导Caspase-1前体的剪切与活化，进而将Pro-IL-1β、Pro-1L-18、Pro-IL-33活化为IL-1β、IL-18、IL-33[21]。NLRP3炎症小体通路能造成细胞凋亡、介导级联炎症反应、引起细胞因子风暴[22]。MAPK信号通路的主要分支包括EBK、p38及JNK，研究[23]证实，三者都参与了病毒的传播与复制。JNK蛋白磷酸化能介导下游AP-1转录因子c-jun与ATF2的活化，从而参与干扰素的形成，并且与细胞凋亡密切相关[23]。

综上，甘露消毒丹中的芳香药物治疗流感的作用机制是一个多基因、多生物过程、多信号通路共同参与的过程，本课题预测了甘露消毒丹中的芳香药物治疗流感的相关分子靶点主要通过激活免疫系统、介导炎症反应，并抑制过度的炎症反应，从而达到抗病毒及减少免疫损伤的治疗目的，为深入探讨甘露消毒丹治疗流感的作用机制，进一步开展有关的实验研究提供了理论依据。