当归芍药散治疗原发性痛经作用机制探讨
——基于网络药理学

原 煜，闫怡洁，张文红

(山西中医药大学 第二临床学院，山西 太原 030024)

痛经是指行经前后或月经期出现下腹部疼痛、坠胀，伴有腰酸或其他不适，其中原发性痛经是指生殖器官无器质性病变的患者，占痛经患者的90%以上[1]，在青年中的发病率较高，严重影响患者的生活、工作与学习[2]。其发病机制尚不明确，西医多采用多种药物联合治疗，但不良反应较大，副作用较高[3]。原发性痛经为中医药治疗的优势病种，临床多通过辨证论治确立治法，副作用小，治愈率高，效果良好。

当归芍药散出自张仲景《金匮要略·妇人病篇》，其中多次用此方治疗妇人各型腹痛[4]，本方由当归、芍药、白术、茯苓、泽泻、川芎组成，主治妇人妊娠或经期腹痛，在临证时多用此方治疗原发性痛经。但当归芍药散治疗原发性痛经的作用机制目前尚不明确，仍需进一步验证。网络药理学多用于研究中药复方对疾病的作用机制，以及新药前期开发，是一种基于多种生物信息学技术的预测方法。因此，本课题运用网络药理学方法，阐述当归芍药散治疗原发性痛经的潜在活性成分、靶点、通路及作用机制，以期为临床提供理论依据及借鉴。

1 材料与方法

1.1 当归芍药散活性成分筛选

中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php)是一种便捷检索药物的工具，其能够捕捉药物、靶标与疾病之间的关系。本课题通过 TCMSP 平台分别搜索当归芍药散含有的7味中药来获取药物相关活性成分。由于当归芍药散所用芍药只有一种，无赤芍、白芍之分，后世医家对此争议颇多，尚无定论[5]，特将赤芍、白芍均纳入范围，因此本课题所检索的7味药物为当归、白术、赤芍、白芍、茯苓、泽泻、川芎。检索药物的基本信息涉及活性成分名称、分子 ID、口服生物利用度(OB)及类药性(DL)等，以OB≥30%、DL≥0.18 为条件对活性成分进行筛选，作为本课题的候选活性成分，筛选每个候选活性成分对应的潜在靶点信息，并去除没有靶点的成分。

1.2 当归芍药散活性成分作用靶点预测

利用 UniProt 数据库(https：//www.uniprot.org/ )，限定物种为“Homo sapiens ”将获取的成分靶点蛋白名称转换为官方基因名称，使获得的成分靶点信息规范统一。最后将当归芍药散中药物、有效成分及其对应的靶点导入 Cytoscape 3.8.0，建立“药物-活性成分-靶点”网络进行分析。

1.3 疾病靶点预测

通过DrugBank 数据库(https：//www.drugbank.ca/)、GeneCards 数据库(https：//www.genecards.org/)、OMIM 数据库(https：//omim.org/)，分别以“ primary dysmenorrhea ”为搜索关键词检索与原发性痛经相关的靶点，集合3个数据库的靶点进行去重处理。

1.4 药物-疾病共同靶点筛选

将当归芍药散活性成分靶点与原发性痛经疾病靶点输入 Venny 2.1.0(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html )在线工具，构建韦恩图，得到共同靶点。

1.5 蛋白质相互作用(PPI)网络构建与分析

将上述筛选出的共同靶点导入 STRING 数据库(https：//string-db.org/ )，物种选择为“ homo sapiens ”，设定置信度阈值> 0.4，获取蛋白间的互作网络，下载 tsv 文件并导入Cytoscape 3.8.0 软件中进行可视化处理，并利用 NetworkAnalyzer功能计算节点度(Degree)参数；使用插件cytoHubba 及MCODE 进行分析。

1.6 共同靶点的GO 功能富集分析与KEGG 通路富集分析

将共同靶点导入 Metascape 数据库，物种设定为“H.Sapiens ”进行 GO 功能富集分析及KEGG 信号通路富集分析，以P<0.05 为筛选条件，得到分析结果。对排名前10的生物学过程(Biological Process，BP)、细胞组分(Cellular Component，CC) 及分子功能(Molecular Function，MF)绘制 GO 分析条形图，对排名前20的 KEGG 通路绘制气泡图，并筛选出可用于解释当归芍药散治疗原发性痛经的通路。

2 结果

2.1 当归芍药散活性成分与潜在靶点预测

阈值设定为OB≥30%、DL≥0.18，删除无对应靶点的化合物，最终共收集到当归活性成分2种，靶点69个；白芍活性成分8种，靶点123个；赤芍活性成分14种，靶点156个；茯苓活性成分6种，靶点30个；白术活性成分4种，靶点23个；泽泻活性成分7种，靶点9个；川芎活性成分6种，靶点42个。删除重复有效成分、靶点后，当归芍药散有效成分38种，相关靶点144个。

2.2 药物-活性成分-靶点网络

将上述筛选结果导入 Cytoscape 3.8.0软件以药物-活性成分-靶点网络的形式呈现(见图1)。该网络由189个节点及499条边组成，其中，菱形节点表示药物，三角形节点表示活性成分，圆形节点表示靶点，围绕同一菱形节点的同色三角形表示该药物的活性成分。内圈三角形节点为药物的共有活性成分：A1、A2、A3来源于白芍及赤芍；B1来源于当归及赤芍；C1来源于当归、白芍及赤芍；D1来源于白芍、赤芍、川芎及泽泻。

对网络进行拓扑分析发现，节点度值明显高于其他成分且度值大于100的有效成分为beta-sitosterol(β-谷甾醇)，相关药物为当归、白芍和赤芍。基于网络药理学算法理论，从单个化合物-靶点网络的角度考虑，β-谷甾醇可能代表这个组方的大部分疗效，即可能是当归芍药散的主要疗效物质。

图1 当归芍药散药物-活性成分-靶点网络

2.3 原发性痛经疾病靶点筛选结果

通过 DrugBank、GeneCards、OMIM 等数据库，共搜集到原发性痛经相关靶点409个，去重处理后，疾病靶点总计335个。

2.4 药物-疾病共同靶点筛选

将当归芍药散144个靶点及原发性痛经335个靶点输入Venny 2.1.0，绘制韦恩图(见图2)，取交集得到共同靶点40个。

图2 当归芍药散-原发性痛经共同靶点韦恩图

2.5 蛋白质相互作用(PPI)网络构建与分析

将40个共同靶点导入STRING 数据库获取蛋白质相互作用关系，并导入 Cytoscape 软件绘制蛋白关系 PPI 网络图(见图3)。该网络包括40个节点、352条边，其中节点表示蛋白，边表示蛋白间的相互作用关系。节点的大小、颜色与此节点的度成正比，即节点越大、颜色越深对应蛋白的degree 值越大。利用 NetworkAnalyzer 功能分析各节点的拓扑参数，计算得到 degree 的平均值为17.6。

使用插件 cytoHubba 计算出得分较高的关键作用靶点(见图4)，包括 TP53、IL6、AKT1、VEGFA、TNF、PTGS2、ESR1、CASP3、CXCL8、FOS，这些靶点在蛋白网络中具有重要的枢纽地位，在当归芍药散治疗原发性痛经中具有重要意义，可作为其有效成分作用的靶点。对 PPI 网络进行 MCODE 模块化分析(见图5)，共有3个模块，表明各模块中的蛋白联系紧密，它们可能共同执行着某个生物过程，如模块1与细胞对激素刺激的反应、对类固醇激素的反应，以及对 DNA 结合转录因子活性的调节有关；模块2与缺乏配体时的信号转导、缺乏配体时的外源性凋亡信号通路及B 细胞稳态有关；模块3与雌激素代谢过程、视黄醇代谢过程、原醇代谢过程有关。

图3 共同靶点 PPI 网络

图4 关键靶点的蛋白相互作用网络

图5 PPI网络的模块分析

2.6 GO功能富集分析和 KEGG 通路富集分析

GO功能富集分析结果显示，40个交集靶点共涉及1 037个生物过程(BP)、19个细胞组分(CC)和68个分子功能(MF)。P值越小，蛋白质生物学功能的显著性越高，故将以上结果按P值升序排序。图6列出了 GO 功能富集分析中P值排名前10位的结果，各条目的数值代表该组富集分析所含有的基因数。其中，生物过程主要涉及细胞因子介导的信号通路、对脂多糖的反应、对类固醇激素的反应、细胞增殖的负调控等；细胞组分方面主要参与膜筏、膜微区、核转录因子复合物、血小板α颗粒等；分子功能主要涉及雌激素16α-羟化酶活性、血红素结合、雌激素2-羟化酶活性、铁离子结合、类固醇羟化酶等方面，结果表明，当归芍药散参与调控体内多种生物学过程，从而发挥治疗原发性痛经的作用。

KEGG通路富集分析结果显示，40个交集靶点共涉及98条通路过程。对当归芍药散治疗原发性痛经有显著影响的生物途径进行筛选，结果显示，其机制主要涉及花生四烯酸代谢、雌激素信号途径、卵巢类固醇生成、类固醇激素生物合成、T 细胞受体信号通路、PI3K-Akt 信号通路、HIF-1 信号通路等。图7中横轴代表富集分数，气泡的大小代表基因数，气泡的颜色代表 pvalue 值。

图6 GO富集分析

图7 KEGG 富集分析

3 讨论

基于女性特殊的生理特点，加之情志与生活等因素的困扰，妇科疾病的病因常为肝郁。妇人以血为用，肝藏血为血海，肝郁使气机阻滞、血液运行失常而致血瘀；肝郁犯胃致脾胃运化失常而脾虚湿蕴，故原发性痛经患者常为肝郁气滞血瘀、脾虚血亏湿蕴所致。当归芍药散具有养血调肝、健脾利湿等功效[6]，治疗原发性痛经疗效显著。现代药理学研究[7]表明，当归具有补血、增强免疫、调经止痛等药理作用。白芍具有解痉、镇痛、抗炎、调节免疫、抗氧化、补血调经等药理作用[8]。赤芍具有保肝、抗血栓、散瘀止痛、清热凉血等药理作用[9]。白术具有抗炎、胃肠调节及抗抑郁等药理作用[10]。茯苓具有免疫调节、抗炎、抗氧化、抗衰老等药理活性[11]。川芎具有镇痛镇静、改善血管功能、保护神经细胞、解热、抗炎等药理作用[12]。泽泻有利尿、抗氧化、抗炎、调节免疫等药理作用[13]。因此，当归芍药散各药物的药理作用明确，可干预人体多个生物过程，激发机体调控网络，其治疗原发性痛经的机制分析如下。

3.1 核心成分及核心靶点

本课题通过对当归芍药散药物-成分-靶点网络的剖析发现，β-谷甾醇度值明显高于其他化合物，该化合物存在于当归、白芍、赤芍中，研究[14]发现，β-谷甾醇具有明显的抗炎、抗氧化、抗焦虑作用，其潜在重要的作用靶点孕酮受体、前列腺素G/H合酶1、前列腺素G/H合酶2均参与了原发性痛经的激素调节通路。cytoHubba结果显示，TP53、IL6、CXCL8、AKT1、VEGFA、TNF、PTGS2、ESR1、CASP3、FOS 等为治疗原发性痛经40个靶点中潜在的重要靶点。

TP53 编码的蛋白对多种细胞应激反应，调节表达靶基因从而诱导细胞周期的改变[15]。T细胞分泌的 IL-6 可强烈收缩子宫，造成局部缺血缺氧，发生炎性反应，使宫腔内组织坏死导致痛经[16]。CXCL8 可以与特异性受体结合，参与调节炎性反应，起到调节女性生殖、生理及病理的作用。AKTI与VEFG 可参与调节血管重塑及血管再生的重要过程，推测 AKT1 在经期利于子宫内膜的恢复，可能与其可以促进新生血管内皮生长有关[17]。作为多效细胞因子的 TNF 在不同的生理、病理条件下产生不同的刺激，参与树突细胞、B细胞、T细胞的发育，诱导细胞凋亡与炎症反应[18]。PTGS2是前列腺素生物合成中的关键酶，与前列腺素的生物合成有关，而痛经的发生主要与子宫内膜前列腺素含量升高有关，故 PTGS2 可能为关键基因靶点。ESR1 对性发育及生殖功能至关重要，它编码的雌激素受体与雌激素结合，激活血清中的肥大细胞，释放致痛物质从而导致痛经[19]。c-fos在生理状态下参与细胞生长分化，但在病理条件下则调控疾病的发生发展[20]。作为细胞凋亡的主要终末剪切酶，CASP3 是 CTL 细胞杀伤机制的重要组成部分。综上，当归芍药散通过调节以上重要靶点，从而达到治疗原发性痛经的作用。

3.2 关键生物过程

由富集分析的结果可知，当归芍药散治疗原发性痛经的通路较多，涉及雌激素信号途径、卵巢类固醇生成、花生四烯酸代谢、类固醇激素生物合成、PI3K-Akt 信号通路、HIF-1信号通路、MAPK 信号通路、T 细胞受体信号通路、胆碱能突触等信号通路，其中，花生四烯酸代谢及雌激素信号通路起关键作用。研究表明，前列腺素在原发性痛经的形成中至关重要，而其生成却受性激素的调节，故原发性痛经与月经周期中的性激素变化密切相关。黄体中期的雌激素高峰在月经前期可促进生成子宫内膜 PGF2α 。孕激素可促进雌二醇转化为无活性的雌酮，当归芍药散活性成分与体内的雌激素竞争受体，产生类雌激素作用，在不增加子宫内膜 PCF2α 的前提下可减少生成前列腺素[21]，减缓子宫的异常收缩，从而缓解痛经[22]。研究[23]发现，MAPK 蛋白在子宫内膜异位症患者的病灶中高表达，这与雌激素对 MAPK 信号通路的激活有关，在鞘内注射 MAPK 信号通路抑制剂可使疼痛消失、病灶缩小，推测原发性痛经的发生可能也与雌激素对MAPK信号通路的激活表达有关。花生四烯酸代谢通路主要参与的基因为 ALOX5、PTGS1、PTGS2，PTGS1、PTGS2为花生四烯酸合成前列腺素类物质的关键性限速酶的异构酶，PTGS2又称为环氧化酶2 (COX-2)，是生成前列腺素的关键酶，其表达在正常生理状态下不易被检测到，仅在转录水平被细胞因子、生长因子等刺激而迅速诱导上调，进而催化花生四烯酸产生多种前列腺素，导致疼痛及炎症反应[24]。若 COX-2 的表达过高，则导致持续收缩子宫肌层从而发生痛经[25]。故当归芍药散可通过该花生四烯酸代谢通路降低前列腺素的生成，减缓痛经程度。此外，当归芍药散还通过 IL-17、Th17 细胞分化等信号通路参与抗炎症机制，通过 T 细胞受体、Toll 样受体、NOD样受体等信号通路参与免疫调节，通过 NF-kappa B 信号通路、鞘脂信号通路、PI3K-Akt 信号通路等参与细胞周期，通过5-羟色胺能突触、胆碱能突触等信号通路参与中枢神经镇痛机制。

4 结语

综上，当归芍药散为多成分、多靶点、多通路的经典方，主要通过激素调节、中枢镇痛、炎症、免疫及细胞周期等方面实现对原发性痛经的治疗作用，但本课题仅在数据库与软件层面研究其作用机制，今后还将在临床试验及动物实验层面加以验证、完善。