G1与G95代次鸡滑液囊支原体的差异蛋白质组学分析

刘凡,郭磊，陈秀红，边海霞，郭亚男，姜肖军，何生虎*

(1. 宁夏大学农学院，宁夏 银川 750021；2. 宁夏晓鸣农牧股份有限公司，宁夏 银川 750021)

鸡滑液囊支原体(Mycoplasmasynoviae)是在20世纪50年代 Olson 等最先提出，临床常引起明显的呼吸道感染，同时可以引起鸡和火鸡的气囊炎、滑膜炎，是禽类动物中一种具有致病性的支原体。1960年起Chalquest将其单独列为一个种属开始研究，同年Lecce首次在传染性滑膜炎的病禽中分离出该病原体。随着时间推移，更多报道发现鸡滑液囊支原体是以造成禽类关节滑液囊膜炎、黏液囊炎及腱鞘滑膜炎等传染性渗出性炎症为主要特征的传染病病原，同时可以定殖在呼吸道引起呼吸道疾病，严重的甚至会引起全身性损伤[1]。鸡群感染后可导致不同症状，如呼吸困难、流鼻涕、蜂窝织炎、关节肿大、跛行、发育缓慢、生长速度降低及胴体品质降级[2]。更为严重的是，感染鸡滑液囊支原体的病鸡同时容易诱发新城疫病毒、禽流感病毒、大肠杆菌、传染性支气管炎病毒等病原微生物混合或者二次感染[3]。

鸡滑液囊支原体是迄今为止发现的具有致病性的禽类支原体中危害最严重的支原体之一[4]。虽然该支原体感染造成的鸡群死亡率仅10%左右[5]，但感染后难以根治，会造成生长发育迟缓、蛋品质下降和免疫抑制等多方面问题，给家禽养殖带来巨大的经济损失[6]。传染性疾病的流行对养殖行业及潜在的公共卫生安全威胁逐年上升，病原变异也使疫病流行趋势日渐复杂，防控工作难上加难[7]。

蛋白质作为细胞功能的执行者是生命活动的重要载体，也是生命体内遗传信息表达最后的表现形式。通过各种技术手段发掘差异蛋白，探究其差异性在生理调控中发挥的具体作用，可以为畜牧业研究揭示生命现象规律提供新的方法和思路，同时还会对生产实践提供具体的理论指导[8]。非标记(label-free)试验方法即非标记定量蛋白质组学技术，是不需要使用同位素标签作为标准，在其质谱分析中通过液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)对蛋白质酶解肽段，依据相应肽段出现不同信号强度从而对相应蛋白质以及含量进行相对定量[9]。近年来人们对鸡滑液囊支原体的研究在不断深入，对一些免疫原性蛋白也进行过相关鉴定，现有进展已发现甘油磷酸二酯磷酸二酯酶(GDPD)是免疫原性蛋白[10]，细胞膜脂蛋白(LP78)、热不稳定延伸因子(EF-Tu)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)也具有免疫原性等[11]。但成果转化为疫苗免疫防控研发都还在发展阶段，病原具体的致病机理也还在探究之中。

根据本实验室前期工作，鸡滑液囊支原体第1代(G1)导致鸡群发病， 95代传代株(G95)不引起相应临床表现。本研究以支原体G1与G95传代株为研究对象，应用非标记法定量蛋白组分析筛选2个代次支原体的差异蛋白质，为后期继续更深入地研究鸡滑液囊支原体传代株毒力减弱的机制奠定基础[12]。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

串联质谱标签(TMT)标记试剂盒，购自Thermo公司；胰酶，购自Promega公司；甲酸，购自Fluka公司；碘代乙酰胺、三乙基碳酸氢铵(TEAB)、蛋白酶抑制剂，购自Calbiochem公司；磷酸酶抑制剂，购自Millipore公司；BCA试剂盒，购自碧云天。

Easy-nLC 1200液相系统(ThermoFisher)，TGL-16A台式冷冻离心机(上海卢湘仪)，SDS-PAGE 电泳仪(北京市六一仪器厂)，ImageScanner扫描仪(EPSON), SCIENTZ-10N冻干机(宁波新芝),高pH分离液相色谱仪(Agilent)。

1.2 样本采集

将实验室-80 ℃冰箱保存的鸡滑液囊支原体G1代次和G95代次按1/10的比例接种于改良Frey液体培养基中，封口后置于37 ℃恒温摇床培养箱中进行菌株的扩增培养。等待液体培养基变成橙黄色后，12 000 r/min条件下离心3 min，弃去上清液，菌体沉淀用无菌PBS液体吹打洗涤，之后按相同条件离心弃掉上清液，重复洗涤 3 次后将样品转移至无菌离心管-80 ℃保存。

1.3 蛋白提取

样品从-80 ℃条件取出后，分别加入 4 倍体积的裂解缓冲液(8 mol/L尿素，1%蛋白酶抑制剂，1%磷酸酶抑制剂)进行超声裂解。混合液完成超声裂解后置于4 ℃，12 000 r/min离心 10 min，上清液转移至新的离心管，选择 BCA 试剂盒进行样品蛋白浓度的测定。

1.4 胰酶酶解

将蛋白溶液中加入二硫苏糖醇使其终浓度为5 mmol/L后，56 ℃条件下还原 30 min。之后加入碘代乙酰胺使其终浓度为 11 mmol/L，在室温避光孵育 15 min。最后将样品的尿素浓度稀释至低于 2 mol/L。接着以胰酶和蛋白按1/50 的质量比例加入胰酶，37 ℃酶解过夜。再按胰酶与蛋白1/100的质量比例加入胰酶，继续酶解 4 h完成胰酶酶解。

1.5 液相色谱-质谱联用分析

肽段用液相色谱流动相A相溶解后使用EASY-nLC 1000超高效液相系统进行分离。后肽段结束超高效液相系统分离后，被注入NSI离子源中进行电离然后进行Q ExactiveTMPlus质谱分析。离子源电压设置为2.0 kV，肽段母离子以及二级碎片使用高分辨的 Orbitrap 进行检测分析。

1.6 数据库搜索生物信息学统计

蛋白鉴定:将蛋白样品原始数据导入Maxquant软件(Maxquant v1.5.2.8)对二级质谱进行数据库搜索，对各组原始数据进行鉴定和相对表达量的比较。本研究所采用的数据库为 SwissProtMouse(16 964条序列)，添加反库以计算随机匹配造成的假阳性率(FDR)，并且在数据库中加入了常见的污染库，用于消除鉴定结果中污染蛋白的影响。

差异蛋白的鉴定及表达分析:在筛选出的可信蛋白基础上，通过评估某一蛋白在样品间的表达水平变化倍数(FC)值和经t检验计算的展现样品间差异显著性P值作为差异蛋白的标准，FC值≥1.5倍且P<0.05为标准筛选差异显著蛋白质。利用蛋白的表达量进行主成分分析(PCA分析)，从不同维度展现样本间的关系。

收集所有蛋白分组富集到的功能分类信息和对应的富集P值，然后筛选出至少在一个蛋白分组中为显著富集(P<0.05)的功能分类。参照Uniprot-GOA 数据库将蛋白ID转换为 Uniprot ID，之后用Uniprot ID去匹配 GO ID，并依据GO ID比对Uniprot-GOA数据库中调取相应的信息进行Gene Ontology的差异蛋白功能富集分析。将2组差异蛋白从细胞组成、分子功能、生物进程三个方面，按照每个条目对应-lgP值由大到小排序的各10条标准继续进行GO富集分析功能描述。

2 结果与分析

2.1 蛋白鉴定

对鸡滑液囊支原体G1和G95传代株蛋白质组进行比较分析，鉴定出样品的可信蛋白总数为428个。

图1中每个点代表试验中的1份检测样品，以不同灰度区分不同G1组和G95组。由图中各组样品在区间的分散点可知，G95组的样品在空间分布较集中,即G95组的3个平行样品的重复性要高于G1组。

2.2 差异蛋白表达分析

2.2.1 差异蛋白的筛选

基于已经筛选出的可信蛋白(每组重复均以能鉴定到可信蛋白为基础进行分析)，计算得到差异显著性P值和每组的差异倍数FC值，按P<0.05且FC值≥1.5倍为标准筛选出69个差异显著蛋白。G95株相比G1株，出现了59个高表达量蛋白，10个低表达量蛋白，具体见表1。

图1 PCA蛋白表达量分析

表1 差异表达蛋白鉴定结果

续表1蛋白ID蛋白名称P值趋势Q4A6E9推定相变血凝素0.014上调Q4A6H0推定相变血凝素>0.001上调Q4A6H7推定相变血凝素0.001上调Q4A6K3未表征的蛋白质0.002上调Q4A6K4酰基神经氨酸裂解酶0.019上调Q4A6K5推定的N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸2-表异构酶>0.001上调Q4A6K6未表征的蛋白质0.001上调Q4A6K7N-乙酰甘露糖胺激酶0.041上调Q4A6K8N-乙酰氨基葡萄糖6-P脱乙酰酶0.008上调Q4A6L1未表征的蛋白质0.006上调Q4A6L2推定的脂蛋白0.002上调Q4A6L4未表征的蛋白质0.001上调Q4A6L5寡肽ABC转运蛋白ATP结合蛋白OppD0.003上调Q4A6L6推定的寡肽ABC转运蛋白ATP结合蛋白OppF0.001上调Q4A6L8推定的寡肽转运系统通透酶蛋白0.005上调Q4A6P7亮氨酰氨肽酶0.001上调Q4A6Q4PTS系统,葡萄糖特异性II ABC成分0.022上调Q4A6S4推测的钾通道蛋白0.003上调Q4A6T7tRNA(鸟嘌呤-N(7)-)-甲基转移酶0.001上调Q4A6V0谷氨酸-tRNA连接酶0.043上调Q4A6Y0未表征的蛋白质>0.001上调Q4A6Y1未表征的蛋白质0.033上调Q4A733DJ-1_PfpI含域蛋白>0.001上调

2.2.2 差异蛋白功能富集分析

69个差异蛋白通过GO分析从分子功能、细胞组成和生物进程进行GO富集分析。下调的差异蛋白一共富集到20条注释，其中分子功能10条、细胞组成4条和生物进程6条，具体见表2。上调差异蛋白一共富集到63条注释，其中分子功能31条、细胞组成7条和生物进程25条具体见表3。

表2 下调差异蛋白GO分析

表3 上调差异蛋白GO分析

续表3编号GO分类条目描述属于该条目的差异蛋白GO:0051205生物进程蛋白质插入膜Q4A5G5GO:0006424生物进程谷氨酰-tRNA氨基酰化Q4A6V0GO:0006427生物进程组氨酰tRNA氨基酰化Q4A5X2GO:0015031生物进程蛋白质转运Q4A6L8; Q4A6L6; Q4A6L5; Q4A5I3; Q4A5G5GO:0015833生物进程肽转运Q4A6L8; Q4A6L6; Q4A6L5GO:0006265生物进程DNA拓扑变化Q4A691; Q4A580GO:0035999生物进程四氢叶酸互变Q4A6B1GO:0019262生物进程N-乙酰神经氨酸分解代谢过程Q4A6K5GO:0005975生物进程碳水化合物代谢过程Q4A6K5; Q4A5V1GO:0006289生物进程核苷酸切除修复Q4A5W3GO:0008033生物进程tRNA加工Q4A5E9GO:0042254生物进程核糖体生物发生Q4A5A0GO:0009401生物进程磷酸烯醇丙酮酸依赖性糖磷酸转移酶系统Q4A6Q4GO:0015986生物进程ATP合成耦合质子传输Q4A603; Q4A602GO:0006364生物进程rRNA加工Q4A5P7GO:0006096生物进程糖酵解过程Q4A5A8GO:0006412生物进程翻译Q4A5C5; Q4A5C9

为进一步了解差异蛋白参与的代谢过程，GO富集分析前30条目显示，下调蛋白、上调蛋白和总的差异蛋白的富集结果是下调蛋白存在于细胞组成分类下的细胞质和分子功能的金属离子结合过程的两个方面。上调蛋白则在三个方面都有相应条目，其中细胞组成条目占5个，染色体位列第一；生物进程占6个，分别是蛋白质转运、肽转运、DNA拓扑变化、碳水化合物代谢过程和翻译过程；分子功能包括10个条目，数值最高的是锰离子结合，DNA拓扑异构酶活性也比较高。全部差异蛋白也有相应三方面的功能注释。具体条目分列的条形图展示如图2、3和4所示。

图2 下调差异蛋白的前30条目GO富集分析

1. 蛋白质转运；2. 肽转运；3. DNA拓扑变化；4. 碳水化合物代谢过程；5. ATP合成耦合质子运输；6. 翻译；7. 染色体；8. 细胞膜；9. 膜的组成部分；10. 质子转运ATP合酶复合物；11. 细胞质；12. 锰离子结合；13. DNA拓扑异构酶活性；14. 水解酶活性；15. 锌离子结合；16. 质子转运ATP合酶活性结合；17. 腺苷三磷酸酶活性；18. ATP结合；19. DNA结合；20. 金属离子结合；21. 核糖体的结构成分

1. 蛋白质转运；2. 肽转运；3. 磷酸烯醇丙酮酸依赖性糖磷酸转移酶系统；4. DNA拓扑变化；5. 碳水化合物代谢过程；6. 核糖体RNA加工；7. ATP合成耦合质子运输；8. 膜的组成部分；9. 翻译；10. 染色体；11. 细胞膜；12. 质子转运ATP合酶复合物；13. 细胞质；14. 锰离子结合；15. 蛋白质-N(PI)-磷酸组氨酸-糖磷酸转移酶活性；16. DNA拓扑异构酶活性；17. 甲基转移酶活性；18. 水解酶活性；19. 激酶活性；20. 锌离子结合；21. 质子转运ATP合酶活性；22. 腺苷三磷酸酶活性；23. GTP结合蛋白

3 讨论

本试验通过非标记法利用数据库检索得到原始数据后，依照相关数据处理方式保留任意一组样本有表达值的比例为≥50%的蛋白。峰面积标准化后取数，即为可信蛋白鉴定出G1株与G95株的差异蛋白。也对差异蛋白进行了GO分析，而蛋白质本身存在结构、功能等客观差异，还有翻译修饰、相互作用等多个更为复杂的动态调控因素，所以此次差异蛋白质的结果不具有唯一性。试验样本鸡滑液囊支原体是无细胞壁的原核生物，虽然结构简单依靠宿主细胞生存，但与宿主细胞之间有着繁多复杂的相互作用。目前的研究已经发现其拥有入侵宿主并在体内复制的能力，而且会引起免疫损伤导致鸡群发病。鸡滑液囊支原体可以与宿主细胞表面受体结合并且出现膜融合现象。同时自身合成代谢过程中也会产生溶细胞酶等有毒的代谢产物[13]。鸡滑液囊支原体还可以侵入并掠夺宿主营养，消耗宿主染色体组蛋白中的精氨酸而引起合成障碍，最终导致宿主染色体损伤。鸡滑液囊支原体的膜蛋白vlhA基因还能介导鸡滑液囊支原体逃避宿主免疫应答[14]。

非标记法定量蛋白质组学分析对G1与G95代次菌株的蛋白分离鉴定出428个可信蛋白，数据筛选后得到69个差异蛋白，包括10个下调蛋白、59个上调蛋白，上调的差异蛋白中还存在4个期变血凝素蛋白，vlhA的产物也包括血凝素可以后续关注，其中14个差异蛋白还未有具体的GO功能显示参考。上调差异蛋白的GO富集条目较多，共富集到63条注释，分别是分子功能31条、细胞组成7条和生物进程25条。其中分子功能主要是描述分子的化学活性，细胞组成主要是指细胞的特定成分，生物进程是生物体内同一系列分子有序的执行某项特定功能也被称为生理进程。在分子功能ATP结合条目就有10个上调的差异蛋白，其他像DNA结合、锰离子结合、锌离子结合、水解酶活性、质子转运ATP和酶活性、DNA拓扑异构酶(ATP水解)活性和核糖体构成过程也都富集到2个及以上的差异蛋白。在细胞组成分类的注释中细胞膜成分、质膜和细胞质差异蛋白数目占比最大，而染色体和核糖体条目仅有个别差异蛋白涉及。生物进程方面蛋白质转运有5个差异蛋白参与，被动运输有3个蛋白参与，DNA拓扑变化、碳水化合物代谢过程、ATP合成质子耦合运输以及翻译都有2个差异蛋白参与，其余生物功能富集注释都为1个差异蛋白。因本试验选取非标记蛋白定量方法，与同位素标记法有所不同的是所有蛋白都未进行标记而进行测量，所以在差异蛋白中未发现NADH氧化酶和二氢硫辛酰胺脱氢酶这类已经报道过的鸡滑液囊支原体膜表面具有免疫原性的蛋白，但是该方法相较于其他蛋白鉴定方法而言，需要的蛋白量少，检测覆盖率更高。而其中上调的59个差异蛋白中，类似2，3-双磷酸甘油酸非依赖性磷酸甘油酸变位酶可以催化2-磷酸甘油和3-磷酸甘油的相互转化，且参与了D-甘油醛3-磷酸合成丙酮酸的亚通路生物过程，子通路又是糖酵解途径的一部分，而糖酵解本身还是碳水化合物降解的一部分，关联着整体生命基本代谢活动的功能蛋白质，可以影响激酶活性、D-氨基葡萄糖PTS渗透酶活性以及蛋白质-N(PI)-磷酸组氨酸-糖磷酸转移酶活性的蛋白质，以及磷酸烯醇丙酮酸依赖糖磷酸转移酶系统中的蛋白质。最新的研究报道发现鸡滑液囊支原体疫苗株MS-H带有移码突变，导致截短的寡肽渗透酶转运体OppF1表达。通过在MS-H基因组中引入OppF1基因的野生型拷贝体外研究突变对疫苗表型的影响，发现突变后的OppF1在MS-H中的染色体拷贝会被野生型OppF1所取代，但该突变对MS-H的生长和衰减的影响尚不清楚[15]。而MS-H是目前唯一的1株商品化弱毒温度敏感型鸡滑液囊支原体疫苗株。本试验鉴定结果在上调的59个差异蛋白中，有3个差异蛋白都是和寡肽转运系统相关的蛋白质，Q4A6L6更是推测为ABC寡肽转运蛋白ATP结合蛋白OppF,影响ATP酶活性、ATP结合和肽转运。这一结果与其他研究结果的关联性可以作为下步研究的重点方向。虽然还未出现鸡滑液囊支原体致病机理的详尽报道，但是作为G1和G95代次菌株鉴定出的差异蛋白结合其毒株弱化等特点，可以在今后的鸡滑液囊支原体致病性等一系列的相关研究中作为重点筛查对象。

对差异蛋白进行GO富集分析功能进一步描述，下调差异蛋白涉及细胞组成分类下的细胞质和分子功能的金属离子结合过程的两个方面，而上调蛋白则包括蛋白质转运、肽转运、DNA拓扑变化、碳水化合物代谢过程和翻译等多个生物学功能都有条目表达。从GO富集分析前 30 条目结果得出，差异蛋白GO注释中蛋白质运输条目富集最多，而翻译出现的频数最低。

综上，试验通过选择减少标定定量对样品限制的非标记蛋白质组学方法分析，在检测样品中鉴定出428个鸡滑液囊支原体可信蛋白，通过条件筛选出2个不同代次的支原体，共有ABC转运蛋白、胸苷激酶、组氨酸-tRNA连接酶等一共69个差异蛋白，其中包括14个无特征蛋白质。相比于G1株传代株G95株的差异蛋白有10个下调、59个上调。GO富集分析结果显示下调和上调的差异蛋白在分子功能、细胞组成和生物进程注释下都有不同数目的富集，依据差异蛋白的GO ID对应Unipot的蛋白功能注释以及前人的研究成果，Q4A6L6作为寡肽转运蛋白的结合蛋白，后续值得继续关注研究其更为具体的生理过程。其他差异蛋白结果也会有助于对鸡滑液囊支原体相关调控机理等问题的深入探究。