非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

张路捷，高雁怩，夏婷婷，白娟，姜平

(南京农业大学/农业农村部动物细菌学重点实验室，江苏 南京 210095)

非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)可引起猪严重疫病，呈现高发病率和死亡率，高热和全身出血等特征，对全球养猪业造成了巨大经济损失，至今尚无有效的商品化疫苗和治疗方法，早期诊断是控制该病的重要方法之一[1]。

ASFV是一个复杂的二十面体双链DNA病毒，基因组长度约为170～190 kb，共编码50多种结构蛋白，其中p72、p54和p30蛋白具有较好的抗原性和免疫原性，可用于ASFV血清学诊断[2-6]。ASFV p30蛋白由CP204L基因编码，属于病毒的早期蛋白，主要参与病毒入侵过程[7]，能够诱导猪体产生较强的免疫反应[8]。本研究根据ASFV Pig/HLJ/2018毒株序列设计引物扩增CP204L(p30)基因，通过原核表达系统获得ASFV重组p30蛋白，制备出2株针对p30蛋白的单克隆抗体，为ASFV诊断和生物学特性研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料

ASFV阳性病料、小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)和pET-32a (+)载体、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪塞内卡病毒A(SVA)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)由本实验室收集保存。SPF级雌性BALB/c小鼠(6～12周龄)购自扬州大学实验动物中心。ASFV感染的猪肺泡巨噬细胞玻片和灭活病毒液由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所制备提供。

DH5α及BL21(DE3)，购自全式金生物技术有限公司；2 × Phanta Max Master Mix和180 kDa Prestained Protein Marker，购自诺唯赞生物科技股份有限公司；限制性核酸内切酶EcoRⅠ、XhoⅠ和T4 DNA连接酶，购自Thermo Fisher Scientific公司；RPMI-1640培养基、胎牛血清，购自美国Gibco公司；羊抗鼠IgG(H+L)-HRP，购自碧云天生物技术有限公司；异硫氰酸荧光素(FITC)-羊抗鼠IgG、小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒，购自Proteintech生物科技有限公司；TanonTM High-sig ECL Western blot底物试剂盒，购自天能科技有限公司；异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、HAT和HT，购自美国Sigma公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 重组质粒构建

参考GenBank数据库中ASFV Pig/HLJ/2018(GenBank MK333180)毒株的CP204L(p30)基因序列设计引物，p30-F:5′- GCGGAATTCAT-GGATTTTATTTTAAATATA -3′，含有EcoRⅠ酶切位点(下划线处)；p30-R:5′- CGCCTCGAGTTTTTTTTTTAAAAGTTTAAT-3′，含有XhoⅠ酶切位点(下划线处)，用于扩增CP204L(p30)基因，大小为582 bp。病毒DNA由ASFV阳性病料中提取。PCR反应条件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 10 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35个循环；72 ℃ 延伸5 min。将目的片段和pET-32a(+)载体经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后进行连接。将连接产物转化至DH5α中，经菌液PCR和双酶切鉴定正确后送通用生物系统公司测序，将测序正确的质粒命名为pET-32a-p30并置于-20 ℃保存备用。

1.3 重组p30蛋白诱导表达及纯化

将重组质粒pET-32a-p30转化至BL21，于含氨苄青霉素的LB液体培养基中培养至菌液OD600 nm为0.6～0.8，加入终浓度为1 mmol/L的IPTG于37 ℃诱导表达6 h。将诱导后菌体进行超声波破碎后于4 ℃ 10 000 r/min离心10 min，分别收集沉淀和上清，通过SDS-PAGE鉴定目的蛋白表达形式。用尿素透析法纯化目的蛋白[9-10]，利用BCA法测定目的蛋白浓度，通过Western blot试验(用ASFV阳性血清)鉴定重组p30蛋白抗原性。重组p30蛋白置于-80 ℃保存备用。

1.4 重组p30蛋白单克隆抗体制备

1.4.1 动物免疫

取5只6～8周龄雌性BALB/c小鼠分别命名为鼠1～5，将纯化的重组p30蛋白与弗氏完全佐剂1∶1混匀乳化，通过皮下多点注射方式免疫小鼠，免疫剂量为50 μg/只。二免、三免用弗氏不完全佐剂乳化，每次免疫间隔2周，第3次免疫后1周对小鼠进行尾部采血，分离血清，用间接ELISA方法测定血清抗体效价；融合前3 d选取抗体效价最高的小鼠进行冲击免疫，腹腔注射100 μg重组蛋白

1.4.2 单克隆抗体制备

冲击免疫后3 d将小鼠安乐死并分离脾细胞，在PEG4000作用下与对数生长期的SP2/0细胞按照7∶1的比例进行细胞融合。将融合细胞铺至含有HAT选择培养基的96孔细胞板中培养。细胞融合7 d后，取100 μL细胞培养上清用间接ELISA方法进行检测。阳性杂交瘤细胞需进行2～3次亚克隆直至抗体阳性率达100%。将稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株扩大培养并冻存于液氮中长期保存。

1.4.3 间接ELISA方法

将重组p30蛋白用碳酸盐抗原包被液稀释至2 μg/mL包被酶标板，于4 ℃包被过夜并用5%脱脂乳于37 ℃封闭2 h。将杂交瘤细胞培养上清作为一抗，加入酶标板，同时设立阴、阳性对照；用PBST洗涤3次后加入100 μL羊抗鼠IgG(H+L)-HRP(1∶1 000稀释)于37 ℃反应45 min；洗涤同上，每孔加入100 μL TMB显色液于37 ℃避光显色10 min；加入50 μL 2 mol/L H2SO4终止反应。用酶标仪测定每孔OD450 nm值，待检样品OD450 nm/阴性样品OD450 nm(S/N)>2.1判定为阳性。

1.4.4 腹水制备

选取12周龄雌性BALB/c小鼠，向小鼠腹腔内注射500 μL无菌液体石蜡。7 d后，向小鼠腹腔中注射3 × 106～4 × 106个杂交瘤细胞。5～7 d后，小鼠的腹部会变大，触之有波动感、行动不敏捷、被毛粗糙时收集腹水，于4 000 r/min离心5 min，取中间层液体，于-80 ℃长期保存备用。

1.5 单克隆抗体生物学特性鉴定

1.5.1 单克隆抗体分泌稳定性及亚型测定

将阳性杂交瘤细胞连续传代培养20代，每隔5代冻存一批细胞，测定不同代次的细胞上清中ELISA抗体效价。按照小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒说明书鉴定其亚型。

1.5.2 Western blot反应性鉴定

取重组p30蛋白及猪肺泡巨噬细胞上增殖的ASFV灭活病毒液，进行SDS-PAGE检测，转印至硝酸纤维素膜(NC膜)上。以杂交瘤细胞上清作为一抗，进行Western blot反应性鉴定，同时设立空载诱导菌体和猪肺泡巨噬细胞作为阴性对照。

1.5.3 间接免疫荧光试验(IFA)反应性鉴定

取ASFV感染猪肺泡巨噬细胞及其玻片(4%多聚甲醛固定)，用PBS(pH = 7.2)洗涤3次后每孔加入200 μL含有2% 牛血清白蛋白(BSA)的PBST溶液，于37 ℃封闭2 h；洗涤同上，每孔加入200 μL杂交瘤细胞培养上清，于37 ℃反应1 h；洗涤同上，每孔加入200 μL FITC-羊抗鼠IgG(用PBST进行1∶200稀释)，37 ℃ 反应1 h后，用PBST重复洗涤3次，将玻片置于在荧光显微镜下观察，使用EVOS FL细胞成像系统拍摄照片并保存。

1.5.4 单克隆抗体特异性鉴定

取PRRSV、PRV、SVA、PEDV和ASFV灭活病毒液进行SDS-PAGE分析，转印至NC膜上。以杂交瘤细胞上清作为一抗，进行Western blot反应性鉴定，同时设立猪肺泡巨噬细胞作为阴性对照。验证单克隆抗体的特异性。

2 结果与分析

2.1 目的基因的扩增及重组质粒的构建

PCR扩增的p30目的基因片段大小为582 bp，与预期相符。将构建的重组质粒pET-32a-p30进行双酶切鉴定，酶切后的目的片段与目的基因大小一致并且基因测序结果完全正确(图1)。

M. DL5000 DNA Marker；1. pET-32a-p30双酶切产物；2. p30基因PCR产物；3. pET-32a-p30重组质粒

2.2 重组p30蛋白表达、纯化及鉴定

SDS-PAGE结果显示，重组菌BL21-p30经IPTG诱导后在50 kDa处有明显条带，与预期大小相符，且为不溶性表达。重组p30蛋白通过尿素透析法纯化后在处出现单一条带(图2A)。Western blot结果表明，ASFV阳性血清能与重组p30蛋白发生特异性反应，证明该蛋白具有良好的抗原性(图2B)。

M. 蛋白分子量标准；1. 重组质粒诱导表达后上清；2. 重组质粒诱导表达后沉淀；3、5. 纯化的重组p30蛋白；4、6. 空载体诱导全菌蛋白

2.3 小鼠血清抗体效价测定

小鼠3次免疫后1周，用本研究建立的间接ELISA方法检测小鼠血清抗体效价。与阴性小鼠相比，免疫组内的所有小鼠均表现出具有较高水平的p30蛋白抗体效价，血清抗体效价均大于1∶25 800。

2.4 单克隆抗体制备及效价测定

采用本研究建立的间接ELISA方法筛选出2株能稳定分泌抗ASFV p30蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，分别命名为2B9和8B9。将2株阳性杂交瘤细胞进行连续传代至20代，细胞上清ELISA抗体效价稳定，用2株阳性杂交瘤细胞制备小鼠腹水，抗体效价较高(表1)。

表1 杂交瘤细胞上清和腹水ELISA抗体效价测定

2.5 单克隆抗体亚型鉴定

结果见如表2，2株单克隆抗体的重链均属于IgG1亚类，轻链均为Kappa型。

表2 单克隆抗体亚型鉴定

2.6 单克隆抗体Western blot反应性鉴定

Western blot结果显示(图3)，2株单克隆抗体均能与重组蛋白以及ASFV感染的猪肺泡巨噬细胞发生特异性反应，而与空载诱导全菌和猪肺泡巨噬细胞不反应。

M. 蛋白分子量标准；1. ASFV 感染后24 h灭活病毒液；2. 非感染细胞对照；3. 重组p30蛋白；4. 空载诱导全菌蛋白

2.7 单克隆抗体IFA反应特性鉴定

IFA试验结果显示(图4)，单克隆抗体制备2B9和8B9均能与ASFV感染的猪肺泡巨噬细胞发生反应，产生特异性的绿色荧光。

2.8 单克隆抗体特异性鉴定

Western blot结果显示(图5)，2株单克隆抗体只能与ASFV感染的猪肺泡巨噬细胞发生特异性反应，而与PRRSV、PRV、SVA和PEDV不发生反应。

图4 抗p30蛋白单克隆抗体与ASFV的IFA反应

M. 蛋白分子量标准；1. PRRSV；2. PRV；3. SVA；4. PEDV；5. ASFV；6. 非感染细胞对照

3 讨论

2018年至今非洲猪瘟对我国养猪业造成了严重的经济损失[11]。目前关于ASFV致病机理以及编码蛋白的功能研究较少，然而单克隆抗体能够在基础研究中发挥重要作用。ASFV单克隆抗体研制主要集中在p72、p54、p30蛋白上[12-15]。p30蛋白在病毒感染早期能促进病毒的内化[16]。相关研究表明，ASFV感染宿主细胞4 h后Western blot能够检测到该蛋白的表达，随后在整个病毒复制周期中持续存在[17]。Oviedo等[18]发现p30蛋白适合用于ELISA抗体检测，并且p30和p54蛋白的联合应用可提高方法ELISA方法的敏感性。研究p30蛋白单克隆抗体有助于ASFV致病机制的研究以及血清学检测方法的建立。本研究通过原核表达技术成功表达重组p30蛋白，Western blot证明该蛋白具有良好的抗原性。将重组p30蛋白免疫BALB/c小鼠，利用间接ELISA方法筛选出2株针对p30蛋白的单克隆抗体，分别为2B9和8B9，为该病毒检测和生物学功能研究提供了有用材料。

单克隆抗体反应特性是决定其应用价值的重要指标。Wu等[15]采用杆状病毒表达重组p30(24～188 aa)蛋白，制备了21株p30蛋白单克隆抗体，并鉴定了4种抗原表位，对ASFV感染的早期诊断具有重大意义。本研究分别测定了2B9和8B9杂交瘤细胞的稳定性、抗体效价、Ig亚型、Western blot和IFA反应性，结果表明2B9和8B9单克隆抗体从P10代开始稳定分泌抗体，腹水抗体效价分别为1∶512 000和1∶128 000，2株单克隆抗体的重链均属于IgG1亚类，轻链均为Kappa型。Western blot反应性鉴定试验显示，2株单克隆抗体均能与ASFV感染的猪肺泡巨噬细胞发生特异性反应，在32 kDa处出现预期的条带。IFA反应性鉴定试验显示，2株单克隆抗体均能够识别ASFV感染的猪肺泡巨噬细胞，证明该2株单抗具有重要应用价值，但其针对的ASFV p30蛋白抗原表位尚需要进一步研究。