传染性法氏囊病病毒的病毒样颗粒制备及免疫原性分析

黄建飞，申翰钦，张钰坤，巫秀红，黄松健，严专强，周庆丰*

(1. 温氏食品集团股份有限公司，广东 云浮 527400；2. 广东省畜禽健康养殖与环境控制企业重点实验室，广东 云浮 527400 3. 华南农业大学动物科学学院，广东 广州 510642；4. 华南农业大学兽医学院，广东 广州 510642)

鸡传染性法氏囊病(infectious bursal disease，IBD)是由传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus，IBDV)引起的一种免疫抑制性传染病，发病率和死亡率高，具有急性、高度的传染性，3～12周龄的雏鸡和青年鸡易感，严重危害世界家禽业，对养鸡业造成了严重的经济损失[1-2]。IBDV基因组编码5种蛋白，分别为VP1、VP2、VP3、VP4和VP5蛋白，其中VP2和VP3是病毒的主要结构蛋白，是病毒核衣壳组成的主要成分。VP2蛋白能诱导中和抗体，与病毒毒力和抗原变异相关，是IBD防控中主要的抗原靶基因[3-5]。

目前市场上IBDV疫苗主要有载体疫苗、中等毒力的弱毒疫苗和灭活疫苗，其中基因工程苗也有相关报道。基因工程苗因其副作用小、免疫原性高等特点，成为生产应用上常见的禽病疫苗[6]。本研究采用原核表达系统，在大肠杆菌中表达IBDV的VP2蛋白。因相关文献报道，融合标签能促进重组蛋白的可溶性表达，本试验采用组氨酸(His)和麦芽糖(MBP)2种融合标签与VP2基因进行融合表达和纯化，烟草蚀纹病毒(tobacco etch virus, TEV)蛋白酶切除标签后形成病毒样颗粒(VLP)，并通过动物试验评估VLP的免疫原性和保护效果，为IBDV基因工程疫苗的研制提供参考。

1 材料与方法

1.1 病毒

IBDV强毒株W2512G-61，由温氏食品集团股份有限公司研究院提供。

1.2 载体与菌株

pSYno-1载体购自常州基宇生物科技有限公司；His-TEV蛋白酶由本实验室制备；BL21(DE3)、TOP10感受态细胞购于TaKaRa公司。

1.3 主要试剂

病毒基因组提取试剂盒(RaPure Viral RNA/DNA Kits)，购自美基生物公司；氨苄青霉素、琼脂糖，购自上海生工生物股份有限公司；Protein Marker,购自Thermo公司；Gold view I型核酸染色剂、DL2000 Marker、DL5000 Marker、一步法转录试剂盒(PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2)、反转录试剂盒(PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit)、PremixExTaqProbe qPCR，均购自TaKaRa公司。

1.4 实验动物

1日龄SPF鸡由大华农生物科技有限公司提供。

1.5 方法

1.5.1 VP2基因原核表达载体的构建

提取IBDV强毒株dsRNA，-20 ℃保存。根据参考文献[7]合成VP2基因的引物。上游引物F:5′-CGAGCTCGATGACAAACCTGCAAGATCAAC-3′(下划线部分为SacⅠ酶切位点)，下游引物R :5′-CCGCTCGAGCGGCACCGGCACAGCTATCTCCTT-3′(下划线部分为XhoⅠ酶切位点)，预期扩增产物大小为1 356 bp ，引物由广州生工生物科技有限公司合成。将VP2扩增的目的片段和原核表达载体pSYno-1分别用SacⅠ/XhoⅠ双酶切，凝胶电泳后，回收各自目的片段，连接后转化TOP10感受态细胞，重组质粒用SacⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定，重组表达质粒命名为pSYno-1-VP2。

1.5.2 重组蛋白的表达与可溶性分析

重组质粒pSYno-1-VP2转化表达菌株BL21(DE3)，挑取重组菌单菌落接种于含有Kana(50 μg/mL)的1 000 mL 的LB培养基，37 ℃ 220 r/min振荡培养至OD600 nm到0.6，加入IPTG(0.5 mmol/L)，在22 ℃ 160 r/min过夜培养诱导蛋白表达，用缓冲液Binding Buffer(20 mmol/L Tris-HCl，300 mmol/L NaCL，pH=8.0)重悬菌体，超声波破碎仪进行破碎，破碎后的混合液 4 ℃、12 000 r/min离心30 min收集上清，通过SDS-PAGE分析，测定蛋白可溶性。

1.5.3 蛋白纯化

收集上述表达的上清加入含有NI-NTA填料的柱子，选用洗杂缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl，300 mmol/L NaCl，50 mmol/L咪唑，pH =8.0)洗去非特异性杂带，最后用洗脱缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl，300 mmol/L NaCl，400 mmol/L咪唑，pH=8.0)洗脱pSYno-1-VP2重组蛋白。通过TEV蛋白酶酶切纯化得到的His-MBP-VP2重组蛋白，4 ℃过夜反应，反应后继续用NI-NTA填料柱进行纯化，收集VP2蛋白，通过透析去除咪唑，浓缩后用BSA蛋白测定VP2蛋白的浓度。

1.5.4 电镜观察

将洗脱后的VP2蛋白用50 mmol/L Tris-HCl与300 mmol/L NaCl作为缓冲液，分析VLP的组装情况和外观，是否形成纳米颗粒，通过透射电镜(TEM)检测收集的蛋白。

1.5.5 VLP免疫原性试验

将纯化后的VP2蛋白与白油佐剂以2∶3体积比混合并乳化，通过颈部皮下免疫接种10只1日龄SPF鸡，免疫剂量为20 μg/只，免疫后7 d加强免疫1次，二免后14 d检测血清抗体并与对照组同时口服攻毒，攻毒剂量为104.0ELD50，攻毒后观察免疫攻毒组和对照攻毒组的临床症状，并在攻毒后3、5和7 d采集肛拭子和血清，攻毒后4和7 d采集组织样品进行相应的抗体和排毒检测。荧光定量PCR反应，引物参考文献[7]，按TaKaRa PremixExTaqTM(Probe qPCR)试剂盒操作，其中20 μL反应体系包含PremixExTaq10 μL，上下游引物各0.4 μL，探针(Probe)0.8 μL，ROX Reference Dye Ⅱ 0.2 μL，模板2 μL，RNase Free dH2O 6.2 μL。反应程序为95 ℃ 5 min；95 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，共计45个循环。

1.5.6 统计与分析

用Graphpad prism 5.0 和SPSS 20.0 软件对试验数据进行作图和统计学分析。数据以“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 VP2基因的扩增

对分离株IBDV-20152010进行核酸提取，通过特异性引物对目的产物进行PCR扩增，得到目的条带长度约为1 356 bp，与预期扩增的基因片段大小相符(图1)。

M. DL2000 Marker；1、2. VP2基因

2.2 重组质粒的酶切鉴定

重组质粒pSYno-1-VP2分别用SacⅠ/XhoⅠ进行双酶切鉴定，结果显示2条条带，其中目的基因片段约为1 300 bp，与预期条带大小相符(图2)。

2.3 重组蛋白的表达

将重组质粒pSYno-1 -VP2转化表达菌BL21(DE3)中，加入IPTG过夜诱导表达，通过SDS-PAGE分析，IPTG诱导后蛋白明显表达，分子量为105 ku，同时通过可溶性分析，上清和沉淀中均有表达(图3)。

M.DL5000 Marker；1. T-VP2双酶切产物；2. T-VP2质粒

M.蛋白Marker；1. Psyno-1-VP2诱导前菌体蛋白；2. Psyno-1-VP2诱导后菌体蛋白；3. Psyno-1-VP2超声破碎后菌体；4. Psyno-1-VP2破碎后上清液；5. Psyno-1-VP2破碎后沉淀

2.4 重组蛋白TEV酶切

将上清中的蛋白加入含有NI-NTA填料的柱子进行纯化，用TEV酶进行酶切，酶切后的产物通过SDS-PAGE鉴定后，再用NI-NTA亲和层析纯化。结果显示，大约90%的VP2重组蛋白通过TEV蛋白酶被切开，得到不含His-MBP标签的VP2目的蛋白，由于二次纯化对目的蛋白损失较大，最终得到的蛋白浓度较低(约0.1 mg/mL)(图4)。

M.蛋白Marker；1.Psyno-1 -VP2镍柱纯化前菌体总蛋白；2.Psyno-1 -VP2过镍柱后菌体总蛋白；3.Psyno-1 -VP2过镍柱后菌体杂蛋白；4.Psyno-1-VP2过镍柱后目的蛋白；5.TEV酶切后的Psyno-1-VP2蛋白；6.VP2目的蛋白；7.浓缩后的VP2目的蛋白

2.5 电镜检测

对目的蛋白VP2进行浓缩，得到更高纯度(1.0 mg/mL)的蛋白，通过透射电镜观察，镜检结果显示形成了明显的病毒样结构以及纳米颗粒状，且结构、大小和形状与预期相符(图5)。

2.6 VLP免疫原性试验

免疫后21 d，免疫组抗体水平明显高于非免疫组(图6A)。攻毒后4 d，非免疫组死亡3只，剖检观察到腿部肌肉有出血点、脾脏肿大、胸腺出血、法氏囊出血等症状；免疫组无死亡，剖检观察腿肌和胸腺无明显临床症状。攻毒后4 d，非免疫组病理组织学观察到脾脏淋巴细胞缺失，内皮细胞裸露和严重坏死，法氏囊囊泡内几乎所有的淋巴细胞均坏死；免疫组病理组织学观察到脾和法氏囊组织结构接近正常，未见明显病理变化(图6B)。从拭子检测结果来看，攻毒后3 d，非免疫组阳性率100%(6/6)，免疫组阳性率16.7%(1/6)；攻毒后5 d，非免疫组阳性率16.7%(1/6)，免疫组无排毒(0/6)；攻毒后7 d，非免疫和免疫组均无排毒(0/6)。

图5 VP2重组蛋白纳米颗粒透射型电子显微图像

A.免疫后14 d抗体水平；B.攻毒后4 d病理学组织切片检测(200×)

攻毒后4 d，与免疫组相比，非免疫组脾体比和囊体比均高于免疫组，且差异显著(P<0.05)(图7A)。攻毒后7 d，与免疫组相比，非免疫组脾体比高于免疫组，且差异显著(P<0.05)，囊体比低于免疫组，且差异极显著(P<0.01)(图7B)；血清qPCR结果显示，攻毒后3 d，与非免疫组相比，免疫组血清病毒载量极显著降低(P<0.01)(图7C)；从组织qPCR结果显示，攻毒后4 d，与非免疫组相比，免疫组脾脏和法氏囊病毒载量极显著降低(P<0.01)(图7D)；攻毒后7 d，与非免疫组相比，免疫组法氏囊病毒载量极显著降低(P<0.01)(图7E)。

3 讨论

目前预防IBDV的主要措施有免疫载体疫苗、灭活疫苗、弱毒疫苗，但载体疫苗产生抗体较慢，灭活疫苗生产成本高，而弱毒疫苗生物安全风险较大。为了解决这一难题，开发了VLP疫苗，通过纯化后的蛋白自我组装成病毒样颗粒，同时具有与真正的病毒粒子相似的空间立体结构，这些VLP既可以诱导B细胞免疫蛋白受体的交联，还参与特异效应B细胞的活化和体液免疫，还可通过CD8+T细胞诱导机体的特异性细胞免疫。正是通过这种方式，使机体产生广泛而强烈的免疫反应，相较于传统疫苗具有更明显的优势，VLP已经成为一种很有前途的疫苗平台[8]。

基于VLP的疫苗已广泛用于疫苗研究，包括乙型肝炎病毒、人乳头瘤病毒和猪圆环病毒2型等等，IBDV VLP疫苗也有相关报道，Rogel等[9]将目的基因插入大肠杆菌表达载体pET-21a中，纯化后的蛋白电镜可观察到VLP，免疫后能够产生抗体；Kibenge等[10]通过杆状病毒表达IBDV目的蛋白，同样可以自动组装成VLP。VLP疫苗的生产、纯化和储存对开发基于VLP的疫苗具有重要意义[11]。本研究旨在评价IBDV VLP疫苗的免疫原性。

目前在蛋白表达系统中，有大肠杆菌、酵母和真核细胞等多种表达系统，其中大肠杆菌表达系统在目前蛋白表达中较为广泛，因其具有操作简便、转化利用率高和价格成本低等优点[12]。本研究使用pSYno-1载体通过原核表达系统对实验室分离的强毒株VP2蛋白进行表达，pSYno-1载体含有His和MBP标签，MBP标签对于蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达有促进作用[6]，同时在融合标签与VP2之间设有TEV蛋白酶切位点，可以特异性除去标签蛋白。

本研究构建了pSYno-1-VP2重组表达载体，转化到BL21(DE3)感受态细胞中，成功表达了融合蛋白，且可溶性蛋白表达量约为50%，通过TEV蛋白酶切后获得目的蛋白，分子质量约为48 ku，与预期蛋白大小一致。电镜结果显示，蛋白在电子显微成像中能够自我组装成病毒样颗粒。由于TEV蛋白酶切割后进行二次纯化中蛋白损失过大，我们选用TEV蛋白酶切开后的蛋白溶液对SPF鸡进行皮下免疫试验。结果表明，与非免疫组相比，免疫组在SPF鸡皮下接种21 d后产生高水平的抗体，初步证实VP2蛋白VLP疫苗具有很好的免疫原性。攻毒保护试验结果显示，攻毒后4和7 d，非免疫组脾体比大于免疫组，表明非免疫组脾脏组织已经发生肿大；攻毒后4 d，非免疫组囊体比大于免疫组，而攻毒后7 d，非免疫组囊体比小于免疫组，这可能是非免疫组在攻毒后4 d法氏囊受损导致成长停滞不前的原因。与非免疫组相比，免疫组拭子、血清和组织的排毒量显著低于非免疫组，从而进一步证明VP2蛋白VLP疫苗能有效刺激机体产生特异性免疫应答，这为研制新型的IBD基因工程疫苗奠定了良好的基础。