不同地域中药蕲蛇多糖含量测定及抗肿瘤作用初步研究

郭 欣 王 维

蕲蛇为蝰科动物五步蛇Agkistrodon acutus（Güenther）的干燥体，具有祛风，通络，止痉等功效，用于风湿顽痹，麻木拘挛，中风，半身不遂，抽搐痉挛，破伤风，麻风疥癣[1]。蕲蛇主要含有氨基酸、骨胶原、脂肪、多糖等成分[2]，药理研究显示，其具有抗炎、镇痛、抑制肿瘤活性和杀死癌细胞的作用[3]。目前以中药蕲蛇组方而成复方制剂金龙胶囊、消癌片、解热除毒丸等在癌症治疗过程中发挥积极疗效，但是由于对蕲蛇研究的不足，其主要的抗肿瘤活性成分并未明晰[4-5]。本研究前期已经分离出蕲蛇多糖和蛋白类成分，多糖类成分在抗肿瘤方面取得很好的效果。蕲蛇蛋白类的成分对肝癌Hep G2、肺癌A549、H1299、白血病KG-1、MEC-1 等在内的多种细胞株有很好抑制作用[6-7]。但是对于动物蛋白、多糖类成分的提取相对困难，且得率较低。因此，我们应用前期建立的适用于中药蕲蛇中多糖含量测定方法，对不同地域的蕲蛇含量的多糖进行测定，比较不同地域蕲蛇多糖含量，并初步探讨其抗肿瘤作用。

1 材 料

1.1 仪器与试剂 UV-2600 紫外分光光度计（岛津公司）、旋转蒸发器-2000 型（上海雅荣生化仪器设备有限公司）、KQ2299DV-超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）、电子分析天平（瑞士梅特勒）、LD4-2A 离心机（北京医用离心机厂）。葡萄糖（中国药品生物制品检定所，供含量测定用）、苯酚（国药集团化学试剂有限公司）、浓硫酸（纯度：98.08%，国药集团化学试剂有限公司）、蒸馏水（MILL-Q 纯水仪制备），其他试剂均为分析纯，购于北京化工厂。噻唑蓝（MTT）（批号B0275）、悬浮细胞培养基1640（RPMI-1640）购自Sigma 公司，改良Eagle 培养基（DMEM）购自Sigma 公司（批号ATCC30-2002）。人肝癌Bel-7404 细胞株由中国科学院上海药物研究所实验室传代培养。

1.2 试验样品 本品为蝰科动物五步蛇Agkisrrodon acutus（Güenther）的干燥体，剖开蛇腹，除去内脏，洗净，盘成圆盘状。中药蕲蛇样品购自浙江省金华市磐安药材城。地域分别为浙江温州（批号20180924）、浙江丽水（批号20190713）、江西九江（批号20190213-4）、福建三明（批号20180932）、四川自贡（批号20190101）。

2 方 法

2.1 溶液制备

2.1.1 5%苯酚溶液制备 精密称取苯酚5.00g 于100mL 棕色量瓶中，加水溶解并定容至刻度，摇匀，得5%苯酚溶液，避光保存。

2.1.2 对照品溶液制备 取于105℃干燥至恒重的无水葡萄糖对照品约12.90mg，精密称定，置25mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为0.516mg/mL 的葡萄糖标准储备液。

2.1.3 供试品溶液制备 总糖供试品溶液制备：分别称取蕲蛇粉末约10mg，置于10mL 量瓶中，加水适量使溶解，再加水定容至刻度，摇匀，4000rpm 离心5min，取上清液。再将蕲蛇稀释5 倍，即得总糖供试品溶液。游离糖供试品溶液制备：分别称取蕲蛇粉末约0.40g，分别置于100mL 三角瓶中，加水20mL 溶解，再加入无水乙醇，使含醇量达到85%，静置过夜，4000rpm 离心5min，取上清液，55℃旋蒸蒸干，残渣用水溶解，转移至25mL 量瓶中，并定容至刻度，再将各样品稀释50 倍，即得游离糖供试品溶液。

2.2 苯酚-浓硫酸试验 精密吸取系列葡萄糖标准溶液，蕲蛇供试品溶液各2mL，置于20mL 具塞玻璃试管中，分别加入5%苯酚溶液1mL，混匀，迅速加入浓硫酸7mL，摇匀，于40℃水浴中保温30min，取出，立即置于冰水浴中5min，恢复至室温，以水为随行空白，于490nm 处测定吸光度。

2.3 MTT 法测定肝癌细胞抑制率 将Bel-7404 细胞株置于无菌及含有15%小牛血清DMEM 培养基培养，以104/孔接种于96 孔板上，培养24h 至细胞贴壁后，分别设置对照组（给予生理盐水20mg/L），将福建三明市产蕲蛇多糖稀释至终浓度为10mg/L（低剂量组）、20mg/L（中剂量组）、30mg/L（高剂量组）继续培养24h，加入MTT 各15μL 继续培养4h，将培养基倾出，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）150μL，震荡混合均匀。以酶标仪于540nm 波长处读取各孔吸光度，计算抑制率。每组实验重复3 次。细胞生长抑制率=（1-实验组OD 值/对照组OD 值）×100%。

3 结果

3.1 最大吸收波长确定 分别精密吸取葡萄糖对照品溶液（51.60μg/mL）和蕲蛇总糖溶液（17.15μg/mL）各2mL 按2.2 操作，于220～800nm 进行光谱扫描，最终确定最大吸收波长为490nm，结果见图1。

图1 对照品和供试品吸收光谱

3.2 线性关系 分别准确吸取葡萄糖标准储备液1.5、2.0、2.5、3.0、3.5mL 于25mL 量瓶中，加水稀释并定容至刻度，得系列浓度为30.96，41.28，51.60，61.92，72.24μg/mL 的葡萄糖标准溶液。利用紫外分光光度计法按上述系列浓度测定多糖含量。选取2.5mL 水显色后的溶液作为空白，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，结果图2。

图2 葡萄糖标准曲线

3.3 精密度试验 精密吸取葡萄糖对照品溶液（浓度为51.60μg/mL）2mL，重复测定吸光度6 次，RSD为0.18%，表明仪器精密度良好。

3.4 稳定性试验

3.4.1 总糖样品稳定性试验 精密吸取总糖供试品溶液2mL，苯酚-浓硫酸显色后分别放置0、2、4、8h测定吸光度（计算含量），总糖样品在0～8h 内稳定性良好，RSD 值为0.83%。

3.4.2 游离糖样品稳定性试验 精密吸取游离糖供试品溶液2mL，苯酚-浓硫酸显色后分别放置0、2、4、8h 测定吸光度（计算含量），游离糖样品在0～8h 内稳定性良好，RSD 值为1.87%。

3.5 重复性试验

3.5.1 总糖样品重复性试验 按2.1.3 操作各精密吸取2mL，6 份总糖样品RSD 为2.83%，提示重复性良好。

3.5.2 游离糖样品重复性试验 按2.1.3 操作得游离糖供试品溶液，各精密吸取2mL，6 份总糖样品RSD 为2.77%，表明重复性良好。

3.6 加样回收试验

3.6.1 总糖加样回收试验 分别称取蕲蛇粉末6份，每份各约10mg，置于10mL 量瓶中，加水适量使溶解，再加水定容至刻度，摇匀，4000rpm 离心5min，取上清液。精密吸取1mL 续滤液，置于50mL 量瓶中，各加入1mL 葡萄糖对照品溶液21.75μg/mL，苯酚-浓硫酸显色后测定吸光度，计算多糖含量，结果显示，总糖平均回收率为99.62%，RSD=1.89%。见表1。

表1 总糖加样回收试验

3.6.2 游离糖加样回收试验 分别称取蕲蛇粉末6份，各约0.40g，分别置于100mL 三角瓶中，加水20mL 溶解，再加入无水乙醇，使含醇量达到85%，静置过夜，4000rpm 离心5min，取上清液，55℃旋蒸蒸干，残渣用水溶解，转移至25mL 量瓶中，并定容至刻度，精密吸取1mL 续滤液，置于50mL 量瓶中，各加入1mL 葡萄糖对照品溶液16.58μg/mL，苯酚-浓硫酸显色后测定吸光度，计算多糖含量，结果显示，总糖平均回收率94.57%，RSD=2.57%。见表2。

表2 游离糖加样回收试验

3.7 样品含量测定 分别选取来自浙江温州、丽水、江西九江、福建三明、四川自贡中药蕲蛇粉末各约0.4g，准确称量，按照上述样品测定方法进行制备并测定多糖含量。温州、丽水、九江、三明、自贡中蕲蛇多糖含量依次为5.83%、7.02%、4.64%、8.65%、6.12%。

表3 不同地域蕲蛇中多糖含量测定结果

3.8 对肝癌Bel-7404 细胞增殖的影响 与对照组相比较，蕲蛇多糖各个剂量组均可显著抑制肝癌Bel-7404 细胞增殖，且差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。其抑制浓度随着蕲蛇多糖含量增加而增强，蕲蛇多糖高剂量组对Bel-7404 细胞抑制率达到82.13%。

表4 MTT 法检测蕲蛇多糖对肝癌细胞抑制作用

4 讨论

随着分子生物学研究领域不断拓展，越来越多从动物中提取的活性成分用于治疗疾病。如从中药守宫中提取的守宫硫酸多糖用于治疗原发性肝细胞癌[8]，从鲍鱼中提取鲍鱼多糖用于抗肿瘤、提高机体免疫力[9]，鲨鱼软骨多糖及海刺参黏多糖抑制肿瘤细胞增殖，广谱抗癌、抗病毒[10]。另有多项研究证实，多糖类成分在抗肿瘤、提高机体免疫力、抗病毒等方面发挥重要作用[11-14]。蕲蛇作为抗肿瘤中成药组方中成分，发挥了重要作用。

然而现行的蕲蛇质量标准较为简单，不能完全控制和确保蕲蛇及其制剂的品质。本研究采用苯酚-浓硫酸显色法对不同地域的中药蕲蛇中多糖含量进行测定，其测定多糖含量原理为多糖在浓硫酸作用下先水解为单糖，单糖脱水后形成糖醛衍生物能与苯酚作用生成橙黄色化合物。在检测波长490nm 处，吸光度和糖浓度呈现线性关系，最终对多糖采用比色法进行定量分析[15]。

本研究结果显示，已建立的多糖含量测定方法具有操作简便，灵敏度高，结果准确可靠等特点，适用于中药中蕲蛇多糖含量的测定。本方法为今后蕲蛇多糖的质量控制、药效评价、药理活性筛查等后续深入研究奠定了基础。同时经过测定结果显示，福建三明、江西九江地区的蕲蛇中多糖含量比较高，其具体原因有待于进一步研究。以蕲蛇为组方的传统中药制剂在临床上应用广泛，但其抗肿瘤主要成分及作用机制目前尚未清晰，本研究筛选了Hep G2、SMMC-7721、Hep 3b、H22，Bel-7404，蕲蛇多糖对其均表现了良好的抑制作用。本研究以蕲蛇中提取的多糖类物质为基础，初步探究其对肝癌细胞株的作用，为今后开展蕲蛇多糖抗肿瘤作用机制，开发新药提供参考。