足细胞损伤中JAK2/STAT3通路与TRPC6相互作用的机制探讨

吴 慢,王先鹤,高 慧,邓 芳

过敏性紫癜性肾炎(henoch-schnlein purpura nephritis,HSPN)是儿童常见的继发性肾小球疾病，可进展至终末期肾脏病，其确切的发病机制尚不明确。足细胞被覆于肾小球基底膜外侧，是肾小球滤过膜,最终也是肾小球最重要的屏障，HSPN的发生与足细胞的损伤有着密切的关系。瞬时受体电位非选择性阳离子通道蛋白(transient receptor potential canonical，TRPC)6位于肾小球足细胞，是裂隙膜的重要组成部分，TRPC6主要介导Ca内流发挥作用。有研究发现，HSPN患儿肾内存在肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system，RAS)的异常活化，血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)作为RAS中主要效应分子，可诱导肾小球细胞损伤，刺激JAK2/STAT3信号通路的过表达引起肾脏炎性。在此过程中，TRPC6也会过度表达。另外有研究表明，Ca能够参与调节JAK2/STAT3信号通路。因此，猜测在Ang Ⅱ损伤足细胞过程中，TRPC6与JAK2/STAT3信号通路存在一定的相互作用关系。该研究以此为出发点来探讨在足细胞中TRPC6通道蛋白与JAK2/STAT3信号通路的相互作用及其机制，为肾脏炎症性疾病防治提供新的药物靶点。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

Ⅳ型胶原酶、胰蛋白酶及转铁蛋白、Ang Ⅱ(美国Sigma公司)；DMEM低糖培养基(美国HyClone公司)；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(以色列BI公司)； TRPC6受体抑制剂 (SKF96365)、Ang Ⅱ受体抑制剂氯沙坦(ab120997)、JAK2/STAT3通路抑制剂(AG490)(上海abcam公司)；反转录试剂盒、实时荧光定量PCR 试剂盒(日本 Takara公司)；实时荧光PCR引物[生工生物工程(上海)股份有限公司]；兔抗TRPC6、p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3抗体(美国CST公司)；兔抗β-actin单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(武汉三鹰公司)；增强化学发光(enhanced chemiluminescent， ECL)试剂盒(上海Tanon公司)；小鼠肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α、小鼠白细胞介素(interleukin,IL)-6、ELISA (enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA)试剂盒(美国R&D公司)。

1.2 方法

1.2.1

小鼠足细胞(mousepodocyte clone,MPC)的分离和培养 MPC细胞株(购自北京北纳创联生物技术研究院，中国医学科学院基础医学研究所系用于全部实)将复苏的足细胞放入 33 ℃、5% CO孵箱中进行传代培养，培养液成分为DMEM低糖培养基、10%胎牛血清以及补充剂(胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸钠)。当细胞生长至70%～80%融合时，转至37 ℃、5% CO孵箱中使用相同的培养液继续培养10～14 d，至细胞分化完全，选择第5～15代分化完全的足细胞用于实验研究。

1.2.2

实验分组 待足细胞长到70%～80% 融合时，接种到6孔板中，使每孔细胞浓度达到80%后用于实验。将实验进行分组：① 对照组(NC组)；② Ang Ⅱ损伤组：加入Ang Ⅱ,使其浓度保持在1 μmol/L；③ Ang Ⅱ+氯沙坦组：加入Ang Ⅱ和氯沙坦,使其浓度分别保持在1 μmol/L和20 μmol/L；④ Ang Ⅱ+AG490组：加入Ang Ⅱ和AG490,使其浓度分别保持在1 μmol/L和40 μmol/L；⑤ Ang Ⅱ+SKF96365组：加入Ang Ⅱ和SKF96365，使其浓度分别保持在1 μmol/L和40 μmol/L。将上述分组在培养箱中继续培养24 h后进行实验。

1.2.3

Western blot检测 取足细胞置于冰上，PBS清洗3遍后，用干净的细胞刷将细胞刮下并搜集，分别提取各组细胞的总蛋白，低温离心后取上清液，用BCA试剂盒测定各组蛋白浓度，加入上样缓冲液煮沸10 min后，每组蛋白取20 μg上样，用10% SDS-PAGE凝胶进行电泳，湿电转至NC膜上，5%脱脂牛奶-PBST溶液室温封闭2 h，再用PBS清洗3遍，分别加入一抗JAK2(1 ∶2 000)；P-JAK2(1 ∶2 000)；STAT3(1 ∶2 000)；P-STAT3(1 ∶2 000)；TRPC6(1 ∶5 000)；β-actin(1 ∶35 000)，于4 ℃孵育过夜后，洗膜，显影，采用β-actin 作为内参，系统软件 Image-J 进行灰度分析。

1.2.4

qRT-PCR检测细胞因子mRNA表达水平 收集各组细胞，采用TRIzol法提取各组细胞 mRNA，并以提取的RNA样品为模板反转录为cDNA。根据SYBR Green试剂盒说明书对cDNA样品进行实时荧光定量PCR。引物序列见表1。反应条件为：95 ℃预变性10 min后进入循环；95 ℃、10 s，60 ℃、30 s，扩增40个循环；每组设3个复孔，采用2法分析相对表达量。

1.2.5

ELISA法检测各组培养上清液细胞因子含量 收取各组细胞上清液，按照ELISA试剂盒说明书用ELISA 方法检测各组细胞TNF-α和IL-6表达水平。

表1 PCR引物列表

2 结果

2.1 Ang Ⅱ对足细胞JAK2/STAT3通路蛋白与TRPC6蛋白表达的影响

对照组、Ang Ⅱ损伤组、Ang Ⅱ+氯沙坦组的p-JAK2表达相对量差异有统计学意义(

F

=23.55、

P

=0.001 4)；3组间的p-STAT3表达相对量差异有统计学意义(

F

=23.40、

P

=0.001 5)；3组间的TRPC6表达相对量差异有统计学意义(

F

=9.73、

P

=0.013 1)。两两比较结果提示，与对照组相比，Ang Ⅱ损伤组的p-JAK2、p-STAT3与TRPC6蛋白表达水平较高(

P

均<0.05)；与Ang Ⅱ损伤组相比，Ang Ⅱ+氯沙坦组p-JAK2、p-STAT3与TRPC6蛋白表达水平较低(

P

均<0.05)。见图1。因此，在足细胞受到Ang Ⅱ刺激时，JAK2/STAT3通路蛋白磷酸化水平与TRPC6蛋白表达量升高。

2.2 AG490对足细胞JAK2/STAT3通路蛋白与TRPC6蛋白表达的影响

对照组、Ang Ⅱ损伤组、Ang Ⅱ+AG490组的p-JAK2表达相对量差异有统计学意义(

F

=20.83、

P

=0.002)；3组间的p-STAT3表达相对量差异有统计学意义(

F

=12.35、

P

=0.008)；3组间的TRPC6表达相对量差异有统计学意义(

F

=6.546、

P

=0.031)。两两比较结果提示，与Ang Ⅱ损伤组相比，Ang Ⅱ+AG490组的p-JAK2、p-STAT3与TRPC6蛋白表达水平较低(

P

均<0.05)。见图2。因此，在AG490对JAK2/STAT3通路的阻断下，不仅JAK2/STAT3通路蛋白磷酸化水平降低，TRPC6蛋白表达量也随着降低。

图1 Ang Ⅱ作用下JAK2/STAT3通路蛋白

2.3 SKF96365对足细胞JAK2/STAT3通路蛋白与TRPC6蛋白的影响

对照组、Ang Ⅱ损伤组、Ang Ⅱ+SKF96365组的p-JAK2表达相对量差异有统计学意义(

F

=13.03、

P

=0.007)；3组间的p-STAT3表达相对量差异有统计学意义(

F

=9.351、

P

=0.014)；3组间的TRPC6表达相对量差异有统计学意义(

F

=26.47、

P

=0.001)。两两比较结果提示，与Ang Ⅱ损伤组相比，Ang Ⅱ+SKF96365组的p-JAK2、p-STAT3与TRPC6蛋白表达水平较低(

P

均<0.05)。详见图3。因此，在SKF96365对TRPC6的阻断下，不仅TRPC6蛋白表达量降低，JAK2/STAT3通路蛋白磷酸化水平也随着降低。

2.4 Ang Ⅱ及各蛋白阻滞剂对足细胞TRPC6 mRNA表达的影响

对照组、Ang Ⅱ损伤组、Ang Ⅱ+氯沙坦组的TRPC6 mRNA表达相对量差异有统计学意义(

F

=39.18、

P

<0.001)；对照组、Ang Ⅱ损伤组、Ang Ⅱ+AG490组的TRPC6 mRNA表达相对量差异有统计学意义(

F

=39.61、

P

<0.001)；对照组、Ang Ⅱ损伤组、Ang Ⅱ+SKF96365组的TRPC6 mRNA表达相对量差异有统计学意义(

F

=37.15、

P

<0.001)。两两比较结果提示，与对照组相比，Ang Ⅱ损伤组的TRPC6 mRNA表达水平较高(

P

<0.05)。与Ang Ⅱ损伤组相比，Ang Ⅱ+氯沙坦组、Ang Ⅱ+AG490组和Ang Ⅱ+SKF96365组的 TRPC6 mRNA表达水平较低(

P

均<0.05)。详见图4。因此，对Ang Ⅱ、JAK2/STAT3和TRPC6的抑制均能降低TRPC6 mRNA的表达。

图2 AG490作用下JAK2/STAT3通路蛋白与TRPC6蛋白表达量 a：对照组；b：Ang Ⅱ损伤组；d: Ang Ⅱ+AG490组；与对照组比较：*P<0.05，***P<0.001；与Ang Ⅱ损伤组比较：#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001

2.5

Ang

Ⅱ及各蛋白阻滞剂对足细胞TNF

-

α、IL

-6

mRNA表达的影响

对照组、Ang Ⅱ损伤组、Ang Ⅱ+氯沙坦组的TNF-α mRNA表达相对量差异有统计学意义(

F

=21.27、

P

=0.002)；对照组、Ang Ⅱ损伤组、Ang Ⅱ+AG490组的TNF-α mRNA表达相对量差异有统计学意义(

F

=23.62、

P

=0.001)；对照组、Ang Ⅱ损伤组、Ang Ⅱ+SKF96365组的TNF-α mRNA表达相对量差异有统计学意义(

F

=32.21、

P

<0.001)。两两比较结果提示，与对照组相比，Ang Ⅱ损伤组的TNF-α表达水平较高(

P

<0.05)；与Ang Ⅱ损伤组相比，Ang Ⅱ+氯沙坦组、Ang Ⅱ+AG490组和Ang Ⅱ+SKF96365组的TNF-α mRNA表达水平较低(

P

均<0.05)。对照组、Ang Ⅱ损伤组、Ang Ⅱ+氯沙坦组的IL-6 mRNA表达相对量差异有统计学意义(

F

=29.30、

P

<0.001)；对照组、Ang Ⅱ损伤组、Ang Ⅱ+AG490组的IL-6 mRNA表达相对量差异有统计学意义(

F

=23.17、

P

=0.002)；对照组、Ang Ⅱ损伤组、Ang Ⅱ+SKF96365组的IL-6 mRNA表达相对量差异有统计学意义(

F

=23.91、

P

=0.001)。两两比较结果提示，与对照组相比，Ang Ⅱ损伤组的IL-6 mRNA表达水平较高(

P

<0.05)；与Ang Ⅱ损伤组相比，Ang Ⅱ+氯沙坦组、Ang Ⅱ+AG490组和Ang Ⅱ+SKF96365组的IL-6 mRNA表达水平较低(

P

均<0.05)。详见图5。

图3 SKF96365作用下JAK2/STAT3通路蛋白与TRPC6蛋白表达量

图4 Ang Ⅱ刺激及各蛋白阻滞剂处理mpc后TRPC6 mRNA表达量

图5 Ang Ⅱ刺激及各蛋白阻滞剂处理mpc后TNF-α、IL-6 mRNA表达量

因此，对Ang Ⅱ、JAK2/STAT3和TRPC6的阻断均能降低炎症因子TNF-α、IL-6mRNA的表达。

2.6 Ang Ⅱ及各蛋白阻滞剂对足细胞TNF-α、IL-6表达的影响

对照组、Ang Ⅱ损伤组、Ang Ⅱ+氯沙坦组、Ang Ⅱ+AG490组、Ang Ⅱ+SKF96365组的TNF-α的表达量差异有统计学意义(

F

=78.35、

P

<0.001)；各组间IL-6的表达量差异有统计学意义(

F

=46.30、

P

<0.001)。两两比较结果提示，与对照组相比，Ang Ⅱ损伤组的TNF-α、IL-6表达量较高(

P

均<0.05)；与Ang Ⅱ损伤组相比，Ang Ⅱ+氯沙坦组、Ang Ⅱ+AG490组和Ang Ⅱ+SKF96365组的TNF-α、IL-6表达量较低(

P

均<0.05)。详见图6。因此，对Ang Ⅱ、JAK2/STAT3和TRPC6的阻断均能降低炎症因子TNF-α、IL-6的表达，与mRNA水平变化趋势与之一致。

3 讨论

HSPN患儿的肾脏损害是影响其预后的重要因素，其发病机制尚未明确。近年来研究发现肾内 RAS 在肾小球滤过率的调节中发挥着重要作用，HSPN患儿肾内存在RAS的异常活化，而Ang Ⅱ作为该系统中主要效应分子参与了肾脏病理炎症改变。本研究通过Ang Ⅱ刺激足细胞，模拟足细胞在炎症中受到的刺激，并通过TRPC6和JAK2/STAT3阻断剂分别抑制TRPC6和JAK2/STAT3的表达，来研究TRPC6离子通道蛋白与JAK2/STAT3信号通路的相互作用与机制。本研究实验结果：① Ang Ⅱ通过上调TRPC6通道蛋白以及JAK2/ATAT3信号通路产生炎症因子，使足细胞损伤：② 通过抑制剂抑制TRPC6通道蛋白能够下调JAK2/STAT3信号通路的表达；③ 通过抑制剂抑制JAK2/STAT3信号通路能够下调TRPC6通道蛋白的表达；④ 分别使用抑制剂抑制JAK2/STAT3信号通路以及TRPC6通道蛋白的同时，炎症因子也在减少，足细胞损伤得到控制。

图6 不同刺激条件下的TNF-α和IL6蛋白表达量

小儿HSPN常常伴有大量蛋白尿，具体机制尚不明确，足细胞作为肾小球滤过膜的重要结构，在蛋白尿中发挥着重要作用。Ang Ⅱ作为炎症递质能够作用于足细胞上足突AT1受体损伤足细胞产生炎症因子，破坏肾小球滤过屏障从而产生大量蛋白尿。TRPC6通道是足突细胞钙转运的重要递质，并参与调节肾小球滤过，其过表达或功能增强可导致足细胞足突消失，使小鼠肾脏受到损伤而诱发蛋白尿。TRPC6的表达与多种细胞因子有关，包括nephrin、 podocin、CD 2AP等这些足细胞骨架蛋白，并且TRPC6能够结合并激活Calpain调节足突细胞骨架、参与细胞黏附和运动。有研究已经发现，Ang Ⅱ能够导致TRPC6启动子活性增加，TRPC6通道过度表达，从而诱导足细胞损伤，本实验一通过Ang Ⅱ刺激足细胞， TRPC6蛋白及mRNA表达量升高，炎症因子TNF-α和IL-6随之增加，从而使足细胞损伤加重；当给予氯沙坦时，TRPC6及TNF-α和IL-6表达量下降，足细胞损伤减轻，从而证实Ang II能够介导足细胞损伤影响TRPC6的表达。

JAK2/STAT3信号通路在炎症中起着重要的作用，能够参与细胞增殖、分化、生长和凋亡。JAK2/STAT3通路对心血管系统的影响也很重要，越来越多的证据表明，JAK2/STAT3通路参与刺激诱导各种心血管并发症，包括凋亡、网状应激、ROS、收缩功能障碍和炎症。有研究表明，Ang Ⅱ能够在多种疾病中激活JAK2/STAT3通路，损伤靶细胞，产生炎症因子，本实验通过Ang Ⅱ刺激足细胞，p-JAK2、p-STAT3蛋白表达增高，炎症因子TNF-α和IL-6也随之增加，足细胞受到损伤；当给予氯沙坦时，p-JAK2、p-STAT3及TNF-α和IL-6表达量下降，足细胞损伤减少，从而证实Ang II能够介导足细胞损伤影响JAK2/STAT3通路的表达同时，TRPC6也能够与多种信号通路发生作用。TRPC6作为一种非选择性的阳离子通道蛋白，主要介导Ca内流发挥作用，并且Ca能够参与调节JAK2/STAT3信号通路。因此，猜测在Ang Ⅱ损伤足细胞过程中，TRPC6与JAK2/STAT3信号通路存在一定的相互作用关系。本研究以此为出发点来探讨在足细胞中TRPC6通道蛋白与JAK2/STAT3信号通路的相互作用及其机制。通过分别加入TRPC6通道蛋白与JAK2/STAT3通路蛋白抑制剂，用Western blot、q-PCR、ELISA等实验方法检测两者蛋白、mRNA、及细胞炎症因子的表达量来验证两者的关系。结果显示，当加入SKF96365时能够下调JAK2/STAT3信号通路蛋白磷酸化的表达，肾脏炎症因子随之减少，足细胞损伤得以减轻；当加入AG490时，TRPC6通道蛋白以及mRNA的表达也在减少，其肾脏炎症因子TNF-α和IL-6也随之减少，足细胞损伤得到改善。但两者的具体联系是否通过Ca介导有待进一步实验验证。

综上所述， Ang Ⅱ能够介导TRPC6通道蛋白激活JAK2/STAT3信号通路，抑制JAK2/STAT3信号通路也能下调TRPC6通道蛋白的表达，为肾脏疾病的研究提供了一个新的方向。