UGRP1与甲状腺结节性质、功能及BRAF基因的相关性

吴 月，杜丹丹，官伟宁，左春林

近年来，甲状腺结节的发病率逐年上升，不同人群的患病率高达19%～67%。超声引导下细针穿刺细胞学检查(ultrasound-guided fine needle aspiration cytology，US-FNAC)是一种创伤小、可靠性高的甲状腺结节评估手段，但该方法所取细胞较少，且难以反应病灶全貌，仍有约15%～30%病变无法明确诊断。子宫球蛋白相关蛋白1(uteroglobin-related protein 1，UGRP1)功能尚未明确，在正常人甲状腺中有少量表达，与自身免疫性甲状腺炎(autoimmune thyroiditis,AITD)的易感位点相关。通过前期研究表明，UGRP1表达阳性的格雷夫斯病(graves′ disease，GD)患者行碘131(I)治疗后易于发生甲状腺功能减退，其表达受多种细胞因子调控。甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)为

BRAF

600基因突变较高的肿瘤之一。该研究以FNAC结果为标准分组，对疑诊甲状腺癌的甲状腺结节行

BRAF

600基因突变检测，通过分析不同性质甲状腺结节患者甲状腺细胞中UGRP1表达情况，探讨其与甲状腺功能、性质、超声特征以及与

BRAF

600基因突变的相关性。

1 材料与方法

1.1 病例资料

收集2019年7月—2020年6月在安徽医科大学第一附属医院肿瘤细胞学室以甲状腺结节为主诉行超声引导下甲状腺结节穿刺活检的131例患者吸取153例甲状腺组织，每例甲状腺组织涂片2张，分别进行HE染色和UGRP1免疫组化染色。其中选取超声诊断且细胞学证实的良性结节22例，取结节旁正常甲状腺组织作为正常对照组。部分可疑恶性结节36例另取一针，将标本置于裂解液中，以荧光PCR法行

BRAF

600基因突变检测。本研究通过安徽医科大学第一附属医院伦理委员会批准。

1.2 主要试剂

一抗：兔抗人UGRP1多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司(1 ∶500)；二抗：PV6000酶标山羊抗兔IgG聚合物购自北京中杉金桥生物技术有限公司(1 ∶1)；PV6000内源性过氧化物酶阻断剂、DAB试剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司；人类

KRAS

/

NRAS

/

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基因突变联合检测试剂盒(荧光PCR法)购自厦门艾德生物医药科技股份有限公司。

1.3 免疫组化实验步骤

-20 ℃冻存切片，内源性过氧化物酶阻断剂37 ℃烤箱孵育30 min，0.3%TRIton-X100溶液37 ℃烤箱30 min，加入一抗(1 ∶500)， 4 ℃冰箱过夜； 滴加即用型二抗37 ℃烤箱孵育30 min，滴加适量新鲜配置的DAB显色液，显微镜下观察控制染色时间，纯水洗净，苏木精复染30 s，自来水冲洗10 min，自然风干后中性树脂封片。

1.4 实验结果判定标准

在光镜下分析，排除非特异染色的前提下，细胞质内有黄色、棕黄色或棕褐色颗粒的细胞为UGRP1阳性细胞。甲状腺功能、甲状腺抗体均由安徽医科大学第一附属医院内分泌科实验室以化学发光法检测。B超为彩色多普勒超声检查。US-FNAC所得细胞在光镜下观察，细胞核有异形、可见包涵体诊断为甲状腺癌，镜下可见淋巴细胞且甲状腺相关抗体升高诊断为桥本甲状腺炎，其余诊断为甲状腺结节。

2 结果

2.1 UGRP1在4组患者甲状腺细胞中的表达

桥本甲状腺炎组(38例)、甲状腺结节组(47例)和甲状腺癌组(46例)UGRP1阳性表达分别为27例、2例、1例，阳性率分别为71.1%、4.3%、2.1%(见图1B、C、D)，正常甲状腺组(22例)中UGRP1阴性表达(见图1A)。桥本甲状腺炎组UGRP1阳性表达率高于正常甲状腺、甲状腺结节和甲状腺癌组，差异有统计学意义(

P

<0.05)。正常甲状腺组、甲状腺结节组、甲状腺癌组UGRP1阳性表达率组间差异无统计学意义。见表1。

2.2 UGRP1阳性组与阴性组的甲状腺功能比较

根据UGRP1的表达情况，将131例患者分为UGRP1阳性组和UGRP1阴性组，结果显示，2组血清中三碘甲状腺氨酸(triiodothyronine，TT3)、甲状腺素(thyroxine，TT4)、促甲状腺激素(thyroid-stimulating hormone，TSH)组间差异无统计学意义。UGRP1阳性组甲状腺过氧化物酶抗体(thyroid peroxidase antibody，TPOAb)、抗甲状腺球蛋白抗体(anti-thyroglobulin antibody，ATG)高于UGRP1阴性组，组间差异有统计学意义(

P

<0.05)。见表2。

图1 UGRP1在甲状腺细胞中的表达 IHC×200

表1 4组甲状腺细胞中UGRP1表达比较

2.3 UGRP1阳性组与UGRP1阴性组的超声特征比较

UGRP1阳性组与UGRP1阴性组结节的回声、形态、边界、有无钙化、纵横比、有无肿大淋巴结、TI-RADS分级2组间差异有统计学意义(

P

<0.05)，而结节的数目、大小、质地、血流情况在2组间差异无统计学意义。见表3。

2.4 甲状腺细胞中UGRP1表达与

基因突变的相关性分析

甲状腺细胞中UGRP1表达与

BRAF

600基因突变存在相关性(

P

=0.023，

C

=0.414)，

BRAF

600基因突变型甲状腺细胞其UGRP1表达倾向于阴性表达。见表4。

表2 UGRP1阳性组与阴性组的甲状腺功能、抗体比较

表3 UGRP1阳性组和阴性表达组的超声特征比较[n(%)]

表4 UGRP表达与BRAFV600E基因突变关系

2.5 二分类logistic回归分析甲状腺结节性质的相关因素

将TT3、TT4、TSH、TPOAb、ATG、UGRP1作为协变量(考虑

BRAF

600缺项影响，故未纳入)，以甲状腺结节良恶性作为应变量，进行二分类logistic回归分析显示，恶性甲状腺结节与UGRP1阳性呈负相关(

P

<0.05)。见表5。

表5 二分类logistic回归分析甲状腺结节性质的相关因素

3 讨论

甲状腺结节的发病率在近十余年迅速增长，随着超声检查在体检中的日益普及，甲状腺结节的检出率日渐增多，其性质判断成为其评估要点。US-FNAC是迄今评估甲状腺结节最可靠的手段。根据Bethesda甲状腺细胞病理学报告系统，将FNAC检查中不能明确诊断其良恶性的结节称为不能确定或可疑的恶性结节，这部分甲状腺结节仅20%～25%术后病理发现为甲状腺癌，而另外的患者则实施了非必要的手术。因此寻找甲状腺结节诊断的生物学标记物作为辅助诊断的指标成为目前研究的关注点之一。

UGRP1基因定位于人染色体5q31-34，有研究表明该区域含有哮喘及AITD易感位点，具有潜在的抗炎作用。前期研究显示，UGRP1在桥本甲状腺炎患者甲状腺组织高表达，并且UGRP1与自杀相关因子和人类白细胞DR抗原在甲状腺细胞中共表达。桥本甲状腺炎超声影像特点为甲状腺弥漫性病变，其合并甲状腺结节在临床上也很常见，桥本甲状腺炎合并PTC发生风险是非桥本甲状腺炎的2.8倍，UGRP1高表达与甲状腺结节的良恶性是否存在关联值得深入探讨。

BRAF

600基因突变是PTC中最常见的遗传变异，总的突变率约为29%～90%，多数学者认为

BRAF

基因突变与PTC的发生和发展密切相关。

BRAF

基因突变最主要是

BRAF

600点突变，可致使

BRAF

蛋白结构中

V

600

E

的氨基酸突变，从而使

BRAF

激酶发生持续性活化。激活丝裂原活化蛋白激酶通路，进一步导致癌变。本研究结果显示：在以甲状腺结节为主诉的患者中，桥本甲状腺炎、甲状腺结节和甲状腺癌患者UGRP1阳性表达率分别为71.1%、4.3%和2.2%，其表达与甲状腺功能无关，回归分析显示甲状腺癌与UGRP1阳性呈负相关。UGRP1阳性表达的甲状腺结节超声影像学表现非低回声、形态规则、边界清晰、无钙化、纵横比<1、无肿大淋巴结、甲状腺超声影像数据和报告系统分级低级别等倾向于良性结节特征，恶性征象的特征包括微小钙化、边缘不规则和纵横比>1的甲状腺结节UGRP1表达为阴性。本研究提示UGRP1可能作为识别桥本甲状腺炎的较好指标，但不能作为识别甲状腺癌的有效标记物。

BRAF

600基因突变是目前已知确定的与PTC致病密切相关的分子标记物，探究甲状腺结节UGRP1阳性或阴性表达与

BRAF

600基因突变型或野生型之间的相关性显然具有一定意义，结果表明甲状腺结节

BRAF

600基因突变型UGRP1呈阴性表达，从另一方面推测UGRP1阳性甲状腺结节发生癌变的可能性不大。