不同缓冲体系下超高压处理对乳铁蛋白结构及理化性质的影响

何晓叶，任 爽，郑伊琰，高彦祥，袁 芳*

（1 中国农业大学食品科学与营养工程学院 教育部功能乳品重点实验室 北京100083 2 农业农村部食物与营养发展研究所 北京100081）

超高压（High Pressure Processing，HPP）是一种非热食品加工技术，近年来在国内外得到广泛的研究。食品的超高压处理技术，是利用水等传压介质在100～1 000 MPa 压力范围使食品内部产生物理、化学及生物效应，从而达到灭菌改性等目的[1]。HPP 技术具有处理温度低，食品营养成分及色香味损失少，处理效率高，能耗少等优点，目前已商业化应用于果汁类产品中。超高压可以通过影响蛋白质的分子体积、非共价键等引起蛋白质分子结构的变化，进而改善蛋白质的功能特性（特别是乳化特性），然而可能具有一定副作用，例如导致蛋白质变性，诱导多肽聚集和解离，改变其表面疏水性、溶解性等物理化学性质[2]。

蛋白质的结构形态与功能性质受多重因素影响，不仅与氨基酸的组成、结构、分子大小等本身属性有关，还与其所处环境有关，如温度、pH 值、离子强度等。在不同离子组成的缓冲体系中，因离子的吸附作用不同，故蛋白质的存在状态和稳定性也不同。pH 值也是影响蛋白质状态的重要因素，它通过改变蛋白质表面的电荷来影响蛋白质分子间的交互作用。有研究表明，在磷酸盐缓冲液中提高压力和保压时间会使鹰嘴豆分离蛋白溶解性明显下降，而增强体系的离子强度能有效阻止这种现象[3]。还有研究表明，经600 MPa 超高压处理，与乳清和脱脂牛乳体系相比，磷酸盐缓冲体系中的牛乳铁蛋白依然保持较高的免疫活性[4]。研究缓冲体系对蛋白质的影响具有重要意义。

乳铁蛋白（Lactoferrin，LF）存在于哺乳动物的外分泌液中，是一条分子质量约80 ku 的铁结合性糖蛋白，这条多肽链上结合有两条糖链，含量为7%左右[5]。牛乳铁蛋白由689 个氨基酸组成，二级结构呈“二枚银杏叶型”，分别在分子的C-端和N-端形成2 个环状结构，且每叶的内部缝隙处都有一个铁结合位点[6]。每个铁结合位点均由4 个氨基酸残基（1 个组氨酸、1 个天冬氨酸、2 个酪氨酸）组成配位体，螯合一个Fe3+。乳铁蛋白的等电点较高，在8.0 以上，这是它区别于其它食品级蛋白质的一项重要性质[7]。乳铁蛋白具有抗菌、抗病毒、免疫调节、抗氧化等多种生物活性，已被广泛应用于各种产品，如婴儿配方奶粉、益生菌、补充片剂、宠物食品、化妆品、食品中铁的天然增溶剂等[8]。

目前有文献报道HPP 处理对乳铁蛋白结构和性质的影响[2，4]，然而几乎没有文献考虑到缓冲体系在其中所起作用。本试验选择磷酸盐（Phosphate buffer saline，PBS）、柠檬酸盐（Citrate buffer saline，CBS）和三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCl）缓冲溶液，分别代表无机盐、有机酸和有机碱缓冲体系，研究不同强度超高压处理对不同缓冲体系中乳铁蛋白二级结构、三级结构及理化性质的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 试验材料与试剂 乳铁蛋白，纯度≥96.2%，铁饱和度为9.85%，美国Hilmar 公司；三羟甲基氨基甲烷（Tris），纯度≥99.9%，日本Lanyi Reagent 公司；5，5'-二硫代双-2-硝基苯甲酸（DTNB），纯度≥98%，美国Sigma 公司；十二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、柠檬酸、柠檬酸三钠、盐酸、氢氧化钠、叠氮化钠、考马斯亮蓝G250、乙醇、磷酸、牛血清白蛋白、甘氨酸、乙二胺四乙酸（EDTA）和尿素，均为分析纯级试剂。

1.1.2 主要仪器与设备 纳米粒度电位仪（Zetasizer Nano-ZS90），英国Malvern 公司；荧光分光光度计（F-7000），日本Hitachi 公司；圆二色性光谱仪（Pistar π-180），英国Applied Photophysics 公司；紫外-可见分光光度计（UV-1800），日本岛津公司；分析天平（AR1140），上海奥豪斯国际贸易有限公司；pH 计（Orion Star），美国Thermo Scientific 公司；超高压设备（HPP L2-700/1），天津华泰森淼生物工程技术有限公司；数显电动磁力搅拌器（78HW-1），江苏荣华仪器制造有限公司；高速离心机（3K15），美国Sigma 公司；冷冻干燥机（LGJ-12），北京松源华兴科技发展有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 乳铁蛋白溶液的制备及超高压处理 将乳铁蛋白粉末分别溶于10 mmol/L 的磷酸盐缓冲液（PBS）、柠檬酸盐缓冲液（CBS）和Tris-HCl 缓冲液中，置磁力搅拌器上搅拌2 h，使其充分溶解，制成质量分数为1%的乳铁蛋白溶液，加入抑菌剂叠氮化钠（质量分数0.02%）防止微生物滋生。将每种缓冲体系的乳铁蛋白溶液分成3 份，用盐酸和氢氧化钠调节其pH 值至3.0，5.0 和7.0，置4℃冰箱溶胀过夜。

将乳铁蛋白溶液以一定体积分装于聚乙烯袋中，用真空包装机封口，置超高压设备的压力腔中，完全浸没于传压介质（去离子水）中，设置压力和时间参数，进行超高压处理。本试验中设置的超高压处理压力分别为200，400 MPa 和600 MPa，时间为30 min，选取常压（0.1 MPa）作对照，升压速率和降压速率分别为6.5 MPa/s 和20 MPa/s。经超高压处理的样品一部分被保存于4℃冰箱待测，另一部分被冷冻干燥为粉末于室温保存待测。

1.2.2 Zeta 电位的测定 利用纳米粒度电位仪测定不同pH 值下超高压处理前、后的乳铁蛋白溶液的Zeta 电位。该仪器基于动态光散射原理（Dynamic light scattering，DLS）分析，通过测量光束的频率和相位的变化来测定颗粒电泳的速度，从而求出Zeta 电位。测定时样品池温度设定为25℃。为了减少多重光散射造成的误差，每个样品重复测定3 次，最终以Zeta 电位（mV）表示颗粒的表面电势。

1.2.3 游离巯基含量的测定参照Qin 等[9]的方法测定不同pH 值下超高压处理前、后乳铁蛋白中游离巯基的含量。首先将4 mg DTNB 溶解于1 mL Tris-甘氨酸缓冲液（0.086 mol/L Tris，0.09 mol/L 甘氨酸，4 mmol/L EDTA，pH=8.0）中配制Ellman's 试剂，称取10～15 mg 乳铁蛋白冻干粉溶解于含8 mol/L 尿素的上述Tris-甘氨酸缓冲液中，向其中加入40 μL Ellman's 试剂，于室温反应30 min，以对应的缓冲溶液作空白对照，用UV-1800 型紫外-可见分光光度计测定样品在波长412 nm 处的吸光值。每个样品测定3 次游离巯基含量后取平均值。样品的游离巯基含量计算公式：

式中，A412nm——波长412 nm 处的吸光度值；C——样品质量浓度，mg/mL；D——稀释倍数（本试验中未稀释）。

1.2.4 紫外吸收光谱分析 将样品用相应缓冲溶液稀释至质量浓度为1 mg/mL，以相应的缓冲溶液作为对照，用UV-1800 型紫外-可见分光光度计测定样品在波长200～400 nm 范围的吸光度，绘制乳铁蛋白的紫外吸收光谱图。

1.2.5 荧光光谱分析参考Sun 等[10]的方法，用相应的缓冲溶液将样品稀释至质量浓度0.2 mg/mL，以LF 分子内荧光基团作为探针，采用F-7000型荧光分光光度计进行荧光光谱扫描。设置激发波长292 nm（激发色氨酸荧光），发射波长300～450 nm，以1 200 nm/min 的扫描速度记录荧光强度的变化。激发和发射狭缝宽度均为10 nm，电压为550 V，以相应的空白缓冲溶液作对照。

1.2.6 圆二色性光谱分析参考Liu 等[11]的方法，将样品用相应缓冲溶液稀释成质量浓度为0.2 mg/mL 的待测液，用Pistar π-180 型圆二色性光谱仪在室温下测定，扫描范围为远紫外区域190～260 nm，样品池光程0.1 nm，扫描速率100 nm/min，分辨率0.2 nm，频带宽度2 nm。所测数据通过网站http：//dichroweb.cryst.bbk.ac.uk[12-13]在线分析。

1.2.7 溶解性 利用考马斯亮蓝法测定溶液中蛋白质含量（μg）变化，探究不同pH 值下超高压处理前、后乳铁蛋白溶解性的变化。将不同处理的乳铁蛋白溶液10 000×g、20℃高速离心15 min，取上清液，用相应的缓冲溶液稀释，用考马斯亮蓝法测定每毫升待测液中蛋白质的含量，每个样品做3 组平行。

1.2.8 统计分析 文中数据为3 次平行试验的平均值，在α=0.05 水平下使用SPSS 16.0 对数据进行显著性分析（ANOVA）。

2 结果与讨论

2.1 超高压对乳铁蛋白三级结构的影响

2.1.1 Zeta 电位分析 蛋白质表面携带的电荷主要来自表面基团的电离作用，通常用Zeta 电位表示蛋白质所带平均电荷[14]。通过测定蛋白质的Zeta 电位了解其带电基团的暴露程度，以进一步分析其三级结构的变化。

从图1可以看出，与水溶液相比，加入缓冲物质后乳铁蛋白表面电位显著降低。据报道，乳铁蛋白等电点约为8.0[7]。在试验的pH 条件下水溶液中的乳铁蛋白表面均带正电荷；而在缓冲液中，由于阴离子的吸附作用，中和了蛋白质表面的正电荷，导致其Zeta 电位降低，等电点随之发生变化。3 种缓冲液中乳铁蛋白的等电点分别降到5～7间，5 左右和7 左右。以水溶液为对照，根据Zeta电位下降幅度不同，可推断3 种缓冲溶液离子吸附能力CBS＞PBS＞Tris-HCl，这可能与3 种缓冲物质的解离常数pKa 值有关。此外，Tris-HCl 缓冲液离子强度较低[15]，也可能是导致其吸附能力弱的原因之一。

图1 不同pH 值条件下不同强度的超高压处理对乳铁蛋白Zeta 电位的影响Fig.1 Effect of different levels of HPP treatments on Zeta potential of LF at different pH

在水溶液中，随超高压处理压力的增加，乳铁蛋白表面电荷没有显著的变化，且变化较无规律。而在缓冲液中，由于存在离子的吸附作用，因此电位的变化趋势与水中明显不同。在PBS 和CBS 缓冲液中pH 3 条件，以及Tris-HCl 缓冲液中pH 3和pH 7 条件下，随着处理压力的升高（200～600 MPa），乳铁蛋白表面电荷量（电位的绝对值）呈上升趋势。有文献报道，蛋白质表面电荷增加可增强分子间的静电排斥作用，提高溶液的稳定性[16]。简俊丽等[17]在研究超高压处理对β-乳球蛋白结构的影响时发现随超高压处理压力的增加，蛋白质表面电位呈上升趋势，推测可能是蛋白质聚集所致。而在PBS 缓冲液中pH 5 和pH 7 以及CBS 缓冲液中pH 5 的条件下，随着压力的升高，乳铁蛋白的Zeta 电位没有发生显著变化（P＞0.05），可能是因为缓冲液中乳铁蛋白等电点发生改变，这些pH值刚好接近蛋白等电点，蛋白质表面电荷接近0，超高压处理后也没有明显变化。

2.1.2 游离巯基含量分析 不同强度超高压处理对不同缓冲液中乳铁蛋白游离巯基含量的影响如图2所示。在PBS 缓冲液中，pH 5 和pH 7 条件下，200～400 MPa 处理的蛋白质游离巯基含量显著下降（P＜0.05），600 MPa 处理的蛋白质游离巯基含量显著上升（P＜0.05），这可能是因为超高压破坏了蛋白质分子内部的非共价键，导致蛋白质结构部分展开，从而暴露出埋藏在内部的巯基基团[9]。在CBS 缓冲液中，过高的压力（600 MPa）使得蛋白质的游离巯基含量下降。Qin 等[9]发现随处理压力的增加，Tris-甘氨酸缓冲液中核桃分离蛋白游离巯基含量先上升后下降，下降的趋势可能是由于进一步增高的压力使得暴露出来的巯基形成二硫键键桥，使部分蛋白质分子发生聚集。CBS缓冲液中pH 7 时游离巯基含量随压力的升高而降低，这与Yang 等[18]研究超高压处理对Tris-甘氨酸缓冲体系中大豆蛋白结构的影响结果一致，分析可能是由于超高压使蛋白质表面的游离巯基通过SH/S-S 交换反应形成分子内二硫键。在Tris-HCl 缓冲液中，pH 7 时，压力增到600 MPa，游离巯基含量显著升高（P＜0.05），达到6.23 μmol/L，是其它条件下游离巯基含量的3～4 倍，这可能是因为Tris-HCl 缓冲体系中蛋白质等电点接近7（见图1d），此时分子间静电排斥作用弱，在高压下易发生变性，甚至产生沉淀。

图2 不同pH 值条件下不同强度的超高压处理对乳铁蛋白游离巯基含量的影响Fig.2 Effect of different levels of HPP treatments on the free SH content of LF at different pH

2.1.3 紫外吸收光谱分析 由于蛋白质分子中酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质有吸收紫外光的性质。蛋白质结构改变导致其氨基酸残基位置和周围环境发生改变，从而引起紫外吸收光谱的变化。

图3显示不同缓冲体系下超高压处理前、后乳铁蛋白紫外吸收光谱的变化。可以看出，PBS 体系中乳铁蛋白紫外吸收光谱受超高压影响程度最大，而CBS 和Tris-HCl 中乳铁蛋白对超高压耐受能力相对较强。有文献报道，PBS 缓冲液中磷酸氢根离子可以催化蛋白质分子聚合[19]，可以与结合金属离子的组氨酸残基反应[20]，这些都可能导致PBS 缓冲体系中蛋白质结构相对不稳定。而Tris-HCl 体系中，除pH 7，600 MPa 条件外，其它条件下蛋白质紫外吸收光谱变化不显著。刘坚等[3]在研究超高压对不同缓冲体系中鹰嘴豆分离蛋白溶解性的影响时，发现Tris-HCl 缓冲体系中蛋白质溶解性的变化最不显著，并称之为抗压型缓冲体系，说明该缓冲体系中蛋白质对超高压耐受能力较强，其结构和性质受超高压影响较小。

在PBS 体系中，酸性条件下超高压对乳铁蛋白三级结构的影响更大。如图3a 显示，随着超高压压力的增加，最大吸光度呈先降后升的趋势，且在400 MPa 时的最大吸光值最低。这说明低强度的超高压处理导致乳铁蛋白的三级结构变得更加致密，色氨酸等疏水性氨基酸被包裹得更深，而高强度的超高压处理使蛋白质变性，结构展开，暴露出更多的内部氨基酸基团。乔宁等[21]研究超高压对绿豆球蛋白结构的影响时也发现，随着压力的增加，蛋白质的最大紫外吸光度先降后升，与本试验结果一致。而在有机缓冲体系中，乳铁蛋白在酸性条件下较稳定，在中性条件下变化较大。CBS 体系中乳铁蛋白的最大紫外吸光度随压力的变化趋势与PBS 体系中的相同，均先降低后升高，不同的是CBS 体系中乳铁蛋白在压力200 MPa 时的最大紫外吸光值最低。在Tris-HCl 缓冲体系中，pH 7 条件下，600 MPa 处理的样品紫外吸收光谱突然升高，且高于其它条件，说明蛋白质的三级结构发生骤变。这一结果与游离巯基含量测定结果相吻合，进一步说明pH 值接近蛋白质等电点时，因分子间静电排斥作用减弱，故超高压处理后蛋白质更易发生变性。

图3 不同强度超高压对乳铁蛋白的紫外吸收光谱的影响Fig.3 Effect of different levels of HPP treatments on UV absorption spectrum of LF

2.1.4 荧光光谱分析 由于作用基团基本一致，荧光光谱与紫外吸收光谱的变化趋势基本一致，结果可互相印证。由图4可见，同一pH 值下，超高压处理未使乳铁蛋白的荧光光谱发生蓝移或红移。Franco 等[4]用400，500 MPa 和600 MPa 压力处理PBS 缓冲液中（pH 7.4）的乳铁蛋白，发现超高压处理并未改变乳铁蛋白荧光光谱的λmax值（即未发生红移和蓝移），与本试验结果一致。与其它pH 值相比，pH 3 时蛋白质荧光光谱的最大发射峰明显红移，说明酸性条件下乳铁蛋白氨基酸所处环境的极性增强。此外，pH 3 时，蛋白质的荧光强度明显高于其它pH 条件的，这可能是由于随着pH 值的下降，乳铁蛋白结合铁离子的能力迅速降低，大量铁离子从蛋白中释放出来，蛋白质的结构稳定性降低，易受超高压处理的影响[22]。

缓冲体系成分对乳铁蛋白最大发射峰的位置无明显影响，说明其氨基酸微环境的极性未改变。此外，从图4可以看出，同一pH 值和压力的条件下，不同缓冲液中乳铁蛋白最大发射峰的荧光强度略有不同：Tris-HCl>CBS>PBS。Su 等[23]发现同一pH 值下PBS 缓冲液中黄嘌呤氧化酶的荧光强度略高于Tris-HCl 缓冲液中氧化酶的荧光强度，与本试验结果有相似之处，分析其可能与缓冲液中溶质的极性有关。PBS 缓冲液的疏水性较强，对蛋白质分子的穿透能力较强，更易于进入蛋白质分子内部而不改变其分子结构，因而分子内部的色氨酸等疏水性氨基酸未能暴露出来，因此检测到的荧光强度偏低。

图4 不同强度超高压对乳铁蛋白的荧光光谱的影响Fig.4 Effect of different levels of HPP treatments on fluorescence of LF

2.2 超高压对乳铁蛋白二级结构的影响

不同超高压处理条件下得到的圆二色谱见图5。乳铁蛋白的远紫外圆二色谱图以反平行β-折叠图谱为特征峰[24]，在pH 3 条件下最小峰值在204 nm 处，在pH 5 和pH 7 条件下最小峰值在210 nm 处，说明缓冲体系的酸碱度影响乳铁蛋白的二级结构。从计算结果看，3 种缓冲液中，同一pH 值和压力条件下，乳铁蛋白的二级结构组成并无明显变化，说明缓冲溶液的种类不影响乳铁蛋白的二级结构。然而，缓冲液的pH 值对二级结构的影响较为显著，从表1中可以看出，pH 3 条件下α-螺旋的含量显著低于pH 5 和pH 7 条件下的含量（P＜0.05），相差约10%；而无规则卷曲的含量显著高于其它条件（P＜0.05），相差约7%。据报道，α-螺旋结构的上升表明蛋白质的二级结构逐渐变得紧凑[25]，α-螺旋结构的下降则表明其结构变得松散；另一方面，无规则卷曲的增加也说明蛋白质的二级结构变得松散[21]。这些结果共同表明酸性条件下乳铁蛋白二级结构的稳定性较差，易变性。由2.1 节分析可知，超高压处理对乳铁蛋白的三级结构影响显著，而经计算发现，其对蛋白的二级结构没有显著影响（P＞0.05）。He 等[2]研究超高压（300～700 MPa）对PBS 缓冲液中牛乳铁蛋白的二级结构的影响时也发现相似结果，分析可能是由于适当的超高压处理促进了乳铁蛋白熔球结构的产生，蛋白质高度水合，保留了较多的二级结构和较少的稳定的三级结构。pH 7 的Tris-HCl 缓冲液中，压力200～400 MPa 时，乳铁蛋白二级结构的组成为21.5%的α-螺旋，29.1%的β-折叠，21.6%的β-转角，27.4%的无规则卷曲，当压力升至600 MPa 时，乳铁蛋白的α-螺旋含量显著降至15.2%，β-折叠显著升至35.6%。据报道，β-折叠在聚集蛋白质中发现的较多[26]，说明处理后的乳铁蛋白的二级结构更加松散，且易于聚集，不稳定。可能是由于此缓冲液中乳铁蛋白的等电点接近7，说明pH 7 条件下蛋白质的结构较不稳定，易发生变性。

图5 不同强度超高压处理对乳铁蛋白的圆二色性光谱的影响Fig.5 Effect of different levels of HPP treatments on the far-UV CD spectra of LF

表1 不同缓冲体系中不同pH 值和压强条件下乳铁蛋白的二级结构组成Table 1 Secondary structure composition of LF at different pH under different pressures in different buffer systems

2.3 超高压对乳铁蛋白溶解性的影响

不同缓冲体系和pH 值条件下超高压对乳铁蛋白溶解性的影响如图6所示。在PBS 体系中，超高压对乳铁蛋白溶解性的影响最大，而在CBS 和Tris-HCl 体系中蛋白质溶解性受超高压的影响较小，这与2.1.3 节紫外吸收光谱的测定结果一致，说明结构的改变导致其溶解性的变化。CBS 体系中蛋白质溶解性几乎不受超高压影响，可能是其强离子吸附作用赋予蛋白质较稳定的溶解性。

随着pH 值的升高，乳铁蛋白溶解度逐渐降低，是由于pH 值越来越接近蛋白质等电点，蛋白质表面电荷逐渐减少，表面基团的水合作用减弱，从而溶解度降低。在变化较明显的PBS 体系中，酸性条件下，随着处理压力的增加，乳铁蛋白的溶解性呈现先减小后增加的趋势，与紫外吸收光谱结果一致。据报道，将蛋白质进行超高压处理时，凝聚的球状蛋白质逐渐伸展和解缔，蛋白质分子内部的极性基团和非极性基团得以暴露，新暴露的极性基团表面的结合水增多，且分子表面电荷增加，可能是导致其溶解度增大的原因之一[20]。在Tris-HCl 中，pH 7 条件下经600 MPa 处理后样品析出大量絮状沉淀，溶解度降幅最大，与2.1 和2.2节的分析结果一致，说明等电点附近蛋白质溶解度受超高压影响最大。

3 结论

超高压处理使乳铁蛋白的三级结构发生显著变化，在不同缓冲液中变化趋势和幅度略有不同，从整体来看，低强度的超高压处理使蛋白质的分子结构趋向紧密，高强度处理则破坏其中的非共价键并导致分子结构的展开和解蒂，暴露出内部疏水性基团；结构的改变导致溶解性发生相应变化，即低压下蛋白质溶解性下降，高压时蛋白质溶解性又回升；超高压处理对乳铁蛋白的二级结构无显著影响。

缓冲液的pH 值、缓冲物质及离子强度等对蛋白质的结构产生不同影响。酸性条件下，乳铁蛋白的氨基酸残基所处微环境极性增强，且由于铁离子释放等原因，在超高压处理过程中结构更易展开。PBS 体系中蛋白质结构最不稳定，超高压处理对其三级结构及溶解性的影响最大，这可能与磷酸氢根的催化能力及其与组氨酸的相互作用有关。缓冲液中离子强度及pKa 值的不同导致离子的吸附能力不同（CBS＞Tris-HCl＞PBS），并导致乳铁蛋白的Zeta 电位和等电点发生不同程度的降低。缓冲物质的种类对乳铁蛋白二级结构无明显影响，然而，酸性pH 值下蛋白质的α-螺旋含量降低，β-折叠含量升高，结构松散不稳定，易发生聚集。综上所述，3 种缓冲液中乳铁蛋白对超高压耐受能力：CBS＞Tris-HCl＞PBS。

图6 不同强度超高压处理前、后不同缓冲体系样品中蛋白质含量Fig.6 Effects of different levels of HPP treatments on solubility of LF at different media