半乳糖凝集素3抑制剂对大鼠椎间盘软骨终板细胞基质金属蛋白酶-3、趋化因子（C-C基元）配体3及聚蛋白多糖表达的影响

刘岩路，胡 炜，艾克拜尔·艾拜也都拉，伊力亚·依力哈木，黄异飞

新疆医科大学附属中医医院脊柱二科，乌鲁木齐 830000

下腰痛主要表现为肋缘和臀下皱襞之间的疼痛、僵硬及肌肉紧张，发生率高，已成为全球性的医疗保健问题［1-2］。在临床上，下腰痛可能是多种疾病的症状，而椎间盘退行性变是导致下腰痛发生的主要因素［3］。椎间盘内无血管走行，营养供应和物质代谢主要靠终板来完成［4］。当软骨终板发生损伤时，会导致椎间盘纤维化、炎性细胞浸润及细胞外基质减少，致使损伤终板所在椎间盘发生渐进性结构改变，最终导致椎间盘形态、稳定性和功能的缺失，从而引起下腰痛［5-7］。

半乳糖凝集素3是一种分子量为29 000 ~ 35 000的蛋白质，属于β-半乳糖苷结合动物凝集素家族，在多种组织中均有表达［8］。近年研究［9］发现，半乳糖凝集素3可作为软骨细胞的标志物和促生因子，促进软骨细胞存活和软骨基质矿化。生物信息学分析发现，半乳糖凝集素3可能主要通过调节炎性因子和趋化因子的表达在骨关节炎的进展中发挥作用［10］。本研究旨在探讨半乳糖凝集素3对基质金属蛋白酶-3（MMP-3）、趋化因子（C-C基元）配体3（CCL3）及聚蛋白多糖的影响，为阐明椎间盘退行性变的机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

大鼠软骨终板细胞和大鼠软骨终板细胞培养基购自武汉普诺赛生命科技有限公司。MTT试剂盒购自德国BioFroxx公司；胎牛血清、胰蛋白酶-EDTA（0.25%）购自美国GIBCO公司；TIANScript反转录试剂盒、SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）实时荧光定量PCR试剂购自北京天根生化科技有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；CCL3兔抗多克隆抗体（A7568）购自武汉爱博泰克生物科技有限公司；MMP-3抗体（EP1186Y）购自美国Abcam公司；聚蛋白多糖多克隆抗体购自北京安诺伦生物科技有限公司。

1.2 细胞传代及分组

参考文献［11］的操作方法，将大鼠软骨终板细胞（1周内提取）从液氮中取出，快速放入37℃水浴锅中，轻摇冻存管使冻存液溶解；溶解后把细胞转移到含有5 mL培养基的离心管中，离心收集细胞（1 000 r/min，离心10 min，离心半径为13.5 cm），用含10%胎牛血清的完全培养基悬浮细胞；将细胞接种到培养皿中，轻轻吹打混匀，在37℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养。间隔2 d更换1次培养液。细胞融合约80%时，使用0.25%胰蛋白酶-EDTA收集细胞，按1∶3传代，将P2代大鼠软骨终板细胞以5×103个/孔接种于96孔板，同时设空白孔，37℃培养过夜。将细胞分为2组，一组加入含25 μmol/L GB1107半乳糖凝集素3抑制剂（抑制剂组），另一组加入等体积空白溶剂（对照组）。

1.3 细胞存活率分析

分组处理完成后12 h、24 h、48 h各取1块96孔板，每孔加入10 μL MTT，37℃培养4 h；吸出培养基，加入150 μL DMSO震荡10 min。用酶标仪测定各孔568 nm处光密度值，计算细胞存活率。以上操作重复3次。

1.4 MMP-3、CCL3及聚蛋白多糖mRNA的表达

分组处理完成后24 h收集细胞，提取总RNA，使用TIANScript反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA。使用DNAMAN软件设计MMP-3、CCL3及聚蛋白多糖的实时荧光定量PCR引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成。内参GAPDH正向引物为5"-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3"，反向引物为5"-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3"；MMP-3正向引物为5"-GAATCCCCTGATGTCCTCGT-3"，反向引物为5"-TTTTCGCCAAAAGTGCCTGT-3"；CCL3正向 引物为5"-GCATTTAGTTCCAGCTCAGTGA-3"，反向引物为5"-GGACGGCAAATTCCACGAAA-3"；聚蛋白多糖正向引物为5"-TGGACTTGTCTCAGGTTTC-3"，反向引物为5"-AGTTGG GGCAGTTATGGAT-3"。实时荧光定量PCR反应体系：10 μmol/L的上、下游引物各0.8 μL，2×SYBR Green预混液10 μL，去RNA酶水6.4 μL，cDNA模板2 μL，配制成20 μL体系，混合均匀。反应条件：95℃ 60 s；95℃ 10 s，60℃ 34 s，40个循环；94℃ 90 s，60℃ 60 s。从60℃按1.1℃/s升温至94℃，获得实时荧光定量PCR反应结果，采用2-ΔΔCt法量化目的基因表达水平。以上操作重复3次。

1.5 MMP-3、CCL3及聚蛋白多糖蛋白的表达

分组处理完成后24 h收集细胞，用PBS洗净细胞，加入120 μL含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min，在4℃下14 000×g（g=9.806 65 m·s-2）离心5 min（离心半径13.5 cm）。取上清液适当稀释后用BCA法测定蛋白浓度，调整蛋白浓度。取50 μg变性蛋白上样，经SDS-PAGE充分分离后，转移至PVDF膜，将膜放入5% BSA封闭液中，置于室温下摇床孵育1 h，加5 mL一抗稀释液（工作浓度均为1∶1 000）于4℃冰箱过夜。次日用TBST洗膜3次，每次10 min，然后加10 mL二抗稀释液（工作浓度为1∶50 000）置于摇床孵育2 h，显色，在暗室中压片曝光显影。用Quantity-one图像软件分析并进行光密度值扫描，计算目的蛋白条带与GAPDH强度比值。以上操作重复3次。

1.6 统计学处理

2 结 果

2.1 半乳糖凝集素3抑制剂对大鼠软骨终板细胞增殖活性的影响

MTT检测结果显示，抑制剂组大鼠软骨终板细胞处理12 h后活性开始逐渐降低，24 h、48 h细胞活性分别为69%和54%。抑制剂组3个时间点的细胞增殖活性均低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05，图1）。

图1 2组大鼠软骨终板细胞活性变化Fig. 1 Changes of activity of rat cartilage endplate cells in 2 groups

2.2 半乳糖凝集素3抑制剂对大鼠软骨终板细胞MMP-3、CCL3、聚蛋白多糖表达的影响

实时荧光定量PCR检测结果显示，抑制剂组大鼠软骨终板细胞中MMP-3、CCL3及聚蛋白多糖的mRNA表达水平均低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05，图2）。蛋白质印迹检测结果显示，抑制剂组大鼠软骨终板细胞中MMP-3、CCL3及聚蛋白多糖的蛋白表达水平均低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05，图3）。

图2 2组大鼠软骨终板细胞MMP-3、CCL3及聚蛋白多糖的mRNA表达Fig. 2 Expressions of MMP-3，CCL3 and aggrecan mRNA of rat cartilage endplate cells in 2 groupsa：MMP-3的mRNA相对表达量 b：CCL3的mRNA相对表达量 c：聚蛋白多糖的mRNA相对表达量a：Relative expression of MMP-3 mRNA b：Relative expression of CCL3 mRNA c：Relative expression of aggrecan mRNA

图3 2组大鼠软骨终板细胞MMP-3、CCL3及聚蛋白多糖的蛋白表达Fig. 3 Expressions of MMP-3，CCL3 and aggrecan protein of rat cartilage endplate cells in 2 groupsa：蛋白质印迹检测 b：MMP-3的蛋白相对表达量 c：CCL3的蛋白相对表达量 d：聚蛋白多糖的蛋白相对表达量a：Western blotting b：Relative expression of MMP-3 protein c：Relative expression of CCL3 protein d：Relative expression of aggrecan protein

3 讨 论

椎间盘退行性变是引起下腰痛的主要因素之一，其致病因素主要包括应力损伤、炎性反应、衰老、菌类感染、营养障碍、遗传和肿瘤等［12-14］。终板是椎间盘的重要组成部分，在维持椎骨正常形态、保护椎骨承受压力及吸收静态压力等方面起着积极作用，同时终板是椎体中渗透转运能力的主要承担者，是椎体的主要营养供应通路［15］。终板的退行性变与椎间盘退行性变的产生有着密切联系，但其确切机制仍不十分清楚。

有研究［16］表明，当软骨终板发生损伤时，促炎细胞因子水平升高，基质降解酶活性增加，软骨细胞外基质中的蛋白多糖活性降低，使细胞外基质大量降解，诱导软骨终板破坏，促进软骨终板发生退行性变，最终导致椎间盘稳态降低、结构破坏等一系列病理改变。本研究结果显示，抑制半乳糖凝集素3后，大鼠软骨终板细胞增殖活性显著降低，加剧细胞退行性变的发生，表明半乳糖凝集素3可以调控软骨细胞活性，进而可能对软骨结构的稳定造成影响，参与椎间盘退行性变的发生。

聚蛋白多糖一般以聚合体的形式在软骨终板细胞基质内发挥聚合作用，起到支撑细胞合成代谢的功能［17］。本研究结果显示，抑制半乳糖凝集素3后，聚蛋白多糖表达量降低，导致细胞支撑力下降，促使细胞凋亡，表明半乳糖凝集素3可以调控聚蛋白多糖表达，进而通过影响软骨细胞的合成代谢，参与椎间盘退行性变的发生。

MMP-3是基质金属蛋白酶家族的主要成员，有研究［18-19］证明，MMP-3过表达会引起细胞外基质降解，最终导致椎间盘发生退行性变。本研究结果显示，抑制半乳糖凝集素3后，大鼠软骨终板细胞MMP-3的mRNA和蛋白表达水平均降低，提示半乳糖凝集素3可能通过调控软骨终板细胞外基质降解在椎间盘退行性变中发挥作用。

CCL3又被称为巨噬细胞炎性蛋白，具有募集巨噬细胞的功能，在炎性反应和免疫应答中发挥重要作用［20］，而巨噬细胞的数量与椎间盘退行性变程度呈正相关［3］。本研究结果显示，抑制半乳糖凝集素3后，大鼠软骨终板细胞CCL3的mRNA和蛋白表达水平均降低，表明半乳糖凝集素3可影响CCL3的表达，可能在椎间盘软骨终板炎性细胞浸润中发挥作用，影响椎间盘退行性变的发生。

综上所述，在软骨终板细胞中抑制半乳糖凝集素3表达会降低软骨终板细胞增殖活性及细胞中MMP-3、CCL3和聚蛋白多糖的表达水平。MMP-3、CCL3的表达水平降低对软骨终板细胞起到保护作用，而聚蛋白多糖表达和软骨终板细胞增殖活性的降低起到促进软骨终板细胞凋亡作用。查阅文献［21］发现，半乳糖凝集素3有2个具有争议的作用，即促进凋亡和抑制凋亡。Heidi等［22］的研究表明，半乳糖凝集素3在细胞内抑制关节和肥大软骨细胞凋亡，促进细胞增殖。但针对某些细胞类型，半乳糖凝集素3也具有促进细胞凋亡作用［23-25］。本研究结果显示，抑制半乳糖凝集素3表达会促进细胞凋亡，诱导椎间盘退行性变的发生。

4 结 论

本研究表明，抑制半乳糖凝集素3表达可抑制软骨终板细胞增殖，促进软骨终板发生退行性变。其可能是通过影响细胞外基质降解、椎间盘炎性细胞浸润和细胞内合成代谢的多重相互作用，来发挥抑制细胞增殖活性的功能。本研究全新阐述了软骨终板退行性变的可能作用机制，也为椎间盘退行性变的预防和治疗提供了新的靶点。