香叶醇烷基改性壳寡糖的高效制备及表征

孙 丹，乐 琳*，王 斌，姜启兴，夏文水，平 原

（1.江南大学 食品学院，江苏 无锡214122；2.食品安全与质量控制协同创新中心，江苏 无锡214122；3.苏州丰倍生物科技有限公司，江苏 苏州215600）

食源性疾病严重危害公众生命健康[1]，尤其近年来，抗生素滥用导致耐药性问题不断加重[2]，因此迫切需要研究和开发新型抗菌材料。

壳寡糖（COS）作为壳聚糖的水解产物，是由氨基葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖通过β-糖苷键连接成的阳离子线型分子，因其很好的溶解性、抗氧化性、抗炎、降脂等生物活性[3-4]，引起科研工作者广泛关注。COS具有抗菌性，在食品、医药、饲料添加剂等领域作为抗菌防腐剂使用。COS的抑菌活性受pH严重影响，在酸性条件下抗菌效果最佳，因此需要通过对壳寡糖进行改性提高其抗菌性[5]。香叶醇是玫瑰精油、香茅精油等精油的主要成分，用于香精和食用香精，还具有较好的抑菌性，但是其水溶性差、易挥发和氧化，不方便利用[6-7]。本研究室Yue等利用香叶醇改性壳寡糖，不仅提高了壳寡糖抗菌性，也便于精油的使用。为了保留壳寡糖的活性氨基，将香叶醇引入壳寡糖的羟基。结果表明，香叶醇接枝产物与壳寡糖相比，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌性更突出[8]，但反应步骤复杂，需经氨基保护、取代反应和脱保护等步骤，最终导致产率较低。因此，本研究直接将香叶醇引入壳寡糖，提高衍生物产率，为高效抗菌剂的大批量生产提供可能[9]。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

香叶醇（Ger）：纯度≥98%，购自阿拉丁试剂（上海）有限公司；壳寡糖：相对分子质量1 500，脱乙酰度≥95%，购自浙江金壳生物化学有限公司；其他化学试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；细菌选取大肠杆菌（ATCC 25922）和金黄色葡萄球菌（ATCC 29273）：江南大学食品学院安全与检测实验室提供。

UV-100紫外-可见分光光度计：购自上海天美科学仪器有限公司；傅立叶红外光谱仪IS10：购自美国Nicolet公司；全数字化核磁共振波谱仪AvanceШ400 MHZ：购自德国布鲁克公司；元素分析仪Vario micro cube：购自德国艾力蒙塔公司；X-衍射波谱仪D2 PHASER：购自德国布鲁克公司；热重分析仪：购自梅特勒-托利多仪器有限公司。

1.2 合成与纯化

参考Yue等的方法并进行改进[8-10]，本研究主要通过香叶醇溴化和取代反应两步操作合成产物，反应流程见图1。

图1 壳寡糖-M-香叶醇合成流程Fig.1 Synthesis diagram of COS-M-Ger

1.2.1 香叶醇溴化 参考Yue等的方法[8-10]：1 mol香叶醇溶解在30 mL无水乙醚，加一定量吡啶作催化剂，搅拌得到澄清溶液；冰浴搅拌，15 min内将0.4 mol三溴化磷乙醚混合液滴入反应溶液；反应结束后，反应体系冷却至30℃以下，加水分层；上层有机层分别用水、质量分数10%的碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液洗涤；有机层用无水硫酸钠干燥过夜；旋转蒸发获得黄色糖浆状产物。

1.2.2 壳寡糖-M-香叶醇制备及纯化 分别制备壳寡糖溶液和香叶醇溴化物溶液：0.005 6 mol壳寡糖溶解在30 mL的二甲基亚砜（DMSO）中，并滴加1～3 mol三乙胺，搅拌至溶液澄清透明；与壳寡糖摩尔比为1∶1、2∶1和3∶1的香叶基溴分别溶解在20 mLN，N-二甲基甲酰胺（DMF）中，在不断搅拌下，分别逐滴加入壳寡糖溶液中，50℃反应6 h[9]。反应溶液冷却至常温，倒入丙酮溶液，离心收集沉淀。45℃真空干燥，产物用石油醚索氏抽提12 h；水溶液透析24 h，真空冷冻干燥得到3个不同取代度的产物COS-M-Ger1、COS-M-Ger2、COS-M-Ger3。

1.3 结构表征

1.3.1 紫外可见光谱 将COS-M-Ger1、COS-MGer2、COS-M-Ger3和COS分别配制成质量浓度为1 g/L的母液，用去离子水稀释10倍；Ger以乙醇为溶剂制成质量浓度2 g/L的母液，再用乙醇稀释100倍；用紫外可见分光光度计在190～600 nm扫描。

1.3.2 红外光谱 采用溴化钾压片法，将COS、COS-M-Ger1、COS-M-Ger2和COS-M-Ger3分别充分研磨至粘壁；用压片模具制成均匀透亮的薄片；Ger、香叶醇溴化物用液膜法，将其滴于溴化钾薄片上，用傅立叶红外光谱仪于400～4 000 cm-1测定红外光谱。

1.3.3 核磁氢谱 COS、COS-M-Ger1和Ger分别以D2O和CDCl3为溶剂，TMS为内标，用核磁共振波谱仪测定物质的核磁氢谱；测试条件：25℃。

1.3.4 元素分析 以磺胺嘧啶为标准，用元素分析仪测定COS、COS-M-Ger1、COS-M-Ger2和COSM-Ger3中有机碳、氮元素的质量分数；COS乙酰度（DA）和产物取代度（DS）分别按公式（1）、（2）计算：

式中：RC/N为壳寡糖中碳、氮质量分数比，MN和MC分别为氮和碳的相对原子质量，R′C/N为衍生物中碳、氮质量分数比。

1.4 产物性质测定

1.4.1 溶解性测定 产物的溶解性测定参考Khan等的方法[11]：25 mg样品溶解在浓度1 mol/L盐酸溶液中，用浓度1 mol/L的NaOH溶液调节pH，用紫外可见分光光度计测定产物在pH 1～10的吸光值，制作溶解曲线；并且测定产物在乙醇、丙酮、乙醚、乙酸、DMF、DMSO等有机溶剂中的溶解性。

1.4.2 结晶度测定 COS、COS-M-Ger1、COS-MGer2和COS-M-Ger3的X-衍射图谱用X-衍射波谱仪测定。条件：扫描范围：5～60°；温度：25℃。

1.4.3 热稳定性测定 通过热分析仪测定COS、COS-M-Ger1、COS-M-Ger2和COS-M-Ger3的热失重曲线；测试条件：加热温度范围30～450℃；N2流量：20 mL/min；升温速率：20℃/min。

1.4.4 抑菌性质研究 菌种活化：参考袁晓娴等的方法[12]，挑取单菌落于LB液体培养基活化12 h，再于LB固体平板上培养；挑取单菌落，在液体培养基中培养至对数期，将菌液稀释到105CFU/mL，用于后续实验。

抑菌和观察：用试管分别配制5 mL质量浓度为1 g/L的COS（编号为d）、Ger（编号为e）、壳寡糖衍生物（COS-M-Ger1、COS-M-Ger2和COS-MGer3，编号分别为f、g、h）、苯甲酸钠（Ben，编号为b）、山梨酸钾（Sor，编号为c）LB液体培养基；取5μL菌液加入各个试管中，无添加抗菌物质的LB培养基为空白对照（Blank，编号为a）。37℃摇床培养3 h后，取100μL培养液与20～25 mL的LB琼脂培养基混匀，冷却后于37℃培养箱培养24 h，拍照观察。

抑菌圈测试：通过平板扩散法研究衍生物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的敏感性。取100μL 105CFU/mL的菌悬液与20～25 mL固体培养基混合均匀，冷却至凝固。用9 mm的打孔器打孔，并在孔中加入200μL 1～8 g/L的抗菌溶液，4℃冰箱预扩散2 h。在37℃培养箱培养24 h，测定抑菌圈直径，每个孔径测试3次。

2 结果与讨论

2.1 UV-Vis光谱

原料COS，Ger和接枝产物COS-M-Ger1、COSM-Ger2和COS-M-Ger3的紫外可见光谱图见图2。COS在280 nm处有个宽大的紫外吸收峰，由壳寡糖残留乙酰基中C=O的n→π*引起；而Ger在215、241 nm处有两个吸收峰，两者分别由香叶醇中非共轭烯烃的n→π*和羟基的n→σ*引起。COS-M-Ger衍生物在197 nm处出现一个吸收峰，是由香叶醇中非共轭烯烃的n→π*跃迁引起，与香叶醇中的跃迁相比发生蓝移，原因是：溶剂对吸收峰有影响——水的极性比乙醇的极性大，烯烃中n电子与水形成氢键，基态n轨道能量降低幅度大，导致n→π*跃迁需要更大能量，吸收带蓝移至197 nm。由图2可知香叶醇修饰的壳寡糖成功制备。

图2 COS、Ger、COS-M-Ger1、COS-M-Ger2和COSM-Ger3的紫外可见光谱图Fig.2 UV-Vis spectra of COS，Ger，COS-M-Ger1，COS-M-Ger2 and COS-M-Ger3

2.2 红外光谱

图3为香叶醇和香叶醇溴化物的红外光谱图，3 300 cm-1左右为羟基的伸缩振动吸收峰，1 670 cm-1处为碳碳双键的伸缩振动峰。Ger-Br红外谱图与Ger相比，3 300 cm-1左右羟基的吸收峰消失，并且在1 200 cm-1和580 cm-1分别出现C-Br的弯曲振动和伸缩振动。

图3 香叶醇和香叶醇溴化物的红外光谱图Fig.3 FT-IR spectra of Ger and Ger-Br

产物和原料的红外吸收图如图4所示。与壳寡糖相比，产物在1 516 cm-1左右的氨基伸缩振动明显减少，壳寡糖中C=O的伸缩振动移动至1 625 cm-1，并且吸收峰变宽，主要是因为：香叶醇引入壳寡糖后，Ger中C=C的伸缩振动和COS中C=O的伸缩振动重合。红外结果表明：香叶醇引入壳寡糖。3个不同取代度的产物COS-M-Ger1、COS-M-Ger2和COS-M-Ger3的红外谱图如图4（b）所示，与之前分析的变化规律吻合。

2.3 核磁氢谱

COS、Ger和COS-M-Ger1的1H-NMR图如图5所示。香叶醇的各个化学位移值归属如下：δ1.61、1.68为CH3上的H吸收峰；δ1.95～2.23为—CH2—上H的化学位移；δ4.144为与—OH相连的—CH2—上H的化学位移；δ4.49为羟基上H的化学位移；δ5.09、5.31分别—C=C—H的化学位移。COS的核磁化学位移值归属：δ2.07和δ3.08～3.15分别归属于N-乙酰葡萄糖胺CH3和NH—的H的化学位移；δ3.32～4.09为糖环上—CH—的化学位移；产物COS-M-Ger除了具有壳寡糖中H的化学位移值，在δ为5.15、5.28处出现了香叶醇—C=C—H的化学位移值；δ2.149、2.071为香叶醇—C=C—H的化学位移值；δ1.731、1.696、1.624为香叶醇CH3的化学位移值；结果表明：香叶醇接入壳寡糖。

图4 原料及衍生物的红外光谱图Fig.4 FT-IR spectra of materials and derivatives

图5 COS、Ger和COS-M-Ger1的核磁氢谱Fig.5 1H-NMR spectra of COS，Ger and COS-M-Ger1

2.4 元素分析

元素分析结果如表1所示。计算得到COS的脱乙酰度为97%；3个产物的取代度分别为0.260，0.278和0.283。由结果可知原料比对产物取代度影响不大。产物的得率为61%～78%，与之前研究的得率11.39%～15.27%相比[8]，提高了4～7倍。

表1 COS、COS-M-Ger1、COS-M-Ger2和COS-M-Ger3的取代度Table 1 Degree of substitution of COS，COS-M-Ger1，COS-M-Ger2 and COS-M-Ger3

2.5 溶解性测定

各物质在有机溶剂中的溶解性如表2所示，衍生物在DMF和DMSO中完全溶解，在乙醇和乙酸中均微溶，与COS相比，产物在有机溶剂中的溶解性均稍有提高。

衍生物在pH为1～10的溶解性如图6中折线图所示。COS在溶液中的溶解性不随pH变化而变化，而衍生物COS-M-Ger1、COS-M-Ger2和COS-M-Ger3在酸性和中性条件下溶解性都很好，在碱性条件下溶解度迅速下降。由图6可观察到：COS-M-Ger1（C）和COS（A）的水溶液澄清透明，Ger（B）在水中完全分层，说明：衍生物比香叶醇溶解性高，比壳寡糖的溶解性稍差。证明：疏水基团的引入降低了产物在碱性条件下的溶解性。

表2 COS、Ger、COS-M-Ger1、COS-M-Ger2和COS-M-Ger3在有机溶剂中的溶解性Table 2 Solubility of COS，Ger，COS-M-Ger1，COS-M-Ger2 and COS-M-Ger3 in organic solvents

图6 COS、COS-M-Ger1、COS-M-Ger2和COS-MGer3不同pH下的溶解性Fig.6 Effect of pH on solubility of COS，COS-M-Ger1，COS-M-Ger2 and COS-M-Ger3

2.6 结晶度

XRD是测定物质结晶度的有效手段，图7为COS、COS-M-Ger1、COS-M-Ger2和COS-M-Ger3的X-射线衍射图。壳寡糖在2θ为13°和23°处有两个衍射峰，分别是壳寡糖Ⅰ型和Ⅱ型结晶的特征峰。与壳寡糖相比，香叶醇接枝物在2θ为13°处的吸收峰无明显变化，2θ为23°处的吸收峰微移至2θ为22°处，且吸收强度稍有增强，说明香叶醇引入壳寡糖后使壳寡糖的内部结构更加有序，导致结晶性略微增加。

2.7 热稳定性

通过热重分析研究物质的热稳定性，图8（a）为质量随温度变化曲线。可以发现所有物质均有两个热失重阶段，COS第一失重阶段是45～150℃，质量损失率为7.5%；第二失重阶段为200～350℃，质量损失率为53.5%；衍生物COS-M-Ger的第一失重阶段为45～120℃，质量损失率为8.2%，第二失重阶段为170～280℃质量损失率为49.8%；第一失重阶段的质量损失是因为物质吸附和结合的水分，第二失重阶段的质量损失是由于物质的热分解。图8（b）为图8（a）的一阶微分曲线，反映了质量损失率随温度的变化。由图8（b）分析，壳寡糖在224℃时，失重率达最大值。3种衍生物在200℃时，失重率达到最大值，从TGA和TG的结果分析，衍生物的热稳定性稍弱于壳寡糖，可能是香叶醇引入壳寡糖后，破坏了分子内氢键作用，导致热稳定性降低。

图7 COS、COS-M-Ger1、COS-M-Ger2和COS-MGer3的X射线衍射图Fig.7 XRD of COS，COS-M-Ger1，COS-M-Ger2 and COS-M-Ger3

图8 COS、COS-M-Ger1、COS-M-Ger2和COS-MGer3的热分析图Fig.8 Thermogravimetric curve of COS，COS-M-Ger1，COS-M-Ger2 and COS-M-Ger3

2.8 抗菌性分析

无菌水（编号为a），苯甲酸钠（编号为b），山梨酸钾（编号为c），壳寡糖（编号为d），香叶醇（编号为e）和3种香叶醇接枝壳寡糖衍生物（分别编号为f、g、h）对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制结果如图9A、9B所示：3种香叶醇接枝壳寡糖衍生物对大肠杆菌的抑制效果优于COS和市售抗菌剂，较低取代度的衍生物抑菌效果稍弱于香叶醇；香叶醇枝接物对金黄色葡萄球菌的抑制作用显著优于COS和市售抗菌剂，与香叶醇抑菌效果几乎一样。抑菌实验表明香叶醇接入壳寡糖，明显增强了产物的抗菌性，因为Ger自身对细菌的抑菌效果比COS显著。

图9 样品对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用Fig.9 Inhibitory effect of products on E.coli and S.aureus

衍生物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径如表3所示：随衍生物取代度增加，抑菌圈直径增大；同一质量浓度下，衍生物对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径比大肠杆菌的大。可见，衍生物对两种细菌的抑菌活性随着取代度的增加而增加，且对金黄色葡萄球菌的抑菌活性好于大肠杆菌。

3 结 语

本研究通过将香叶醇溴化和取代，制备了高产率的抗菌物质。采用UV-Vis、FT-IR和1H-NMR等表征手段证明：产物成功合成。元素分析得到3个产物（COS-M-Ger1、COS-M-Ger2和COS-M-Ger3）的取代度分别为：0.260、0.278、0.283。溶解性分析表明：与香叶醇相比，产物在水溶液中的溶解性更高。结晶度和热稳定分析表明：衍生物的结晶性稍好于壳寡糖，但是热稳定性变差。抗菌实验表明：COSM-Ger1、COS-M-Ger2和COS-M-Ger3对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有较好的抑菌效果。抗菌性壳寡糖的合成为新型抗菌剂的工业化生产提供可能。

表3 不同衍生物对E.coli和S.aureus抑菌圈直径Table 3 Inhibitory zone diameter of derivatives with different concentrations单位：mm