七氟醚对结直肠癌细胞侵袭迁移的影响及对microRNA-203的调控作用机制研究

孙飞，黄用豪

（天津市人民医院麻醉科，天津300121）

结直肠癌是消化道最常见恶性肿瘤之一，具有发病率高、恶性程度高、预后不良等特点，严重危害人类生命健康[1-2]。结直肠癌细胞持续性无限增殖、浸润及转移是导致患者死亡的主要原因。七氟醚是临床常用的吸入性麻醉药物，广泛应用于多种手术，与恶性肿瘤关系密切，参与胶质瘤、骨肉瘤、乳腺癌等肿瘤细胞生物学行为变化过程[3-5]。microRNA（miRNA）是一类非编码RNA，参与细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移等生理过程，microRNA-203（miR-203）是miRNA 家族中重要一员，是抑癌非编码小分子RNA 之一，其表达水平与肿瘤发生发展过程密切相关[6]。既往研究发现，七氟醚可以通过调控miR-203 表达影响肿瘤细胞生物学行为，但其在结直肠癌方面报道较少[7]。本研究通过体外实验观察七氟醚对人结直肠癌HCT116细胞侵袭、迁移的影响以及对miR-203 的调控作用，探讨其可能作用机制，为临床诊治结直肠癌提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系人结直肠癌细胞株HCT116 购于中国科学院上海细胞库。

1.1.2 药物、主要试剂和仪器七氟醚（美国Baxter公司），DMEM 培养基、胎牛血清（FBS）（美国Gibco公司），Transwell 细胞培养小室（美国Corning 公司），900 型麻醉机（美国欧美达公司），miR-203 过表达质粒及相应空载体质粒（上海吉凯基因化学技术有限公司），兔抗人细胞外信号调节激酶（ERK）多抗、p-ERK 多抗和基质金属蛋白酶-9（MMP-9）多抗（美国CST 公司），山羊抗兔IgG-HRP（美国Abcam 公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养人结直肠癌HCT116 细胞接种于DMEM 培养基（质量分数10% FBS+100 u/ml 青霉素+100 μg/ml 链霉素），置于体积分数5%二氧化碳CO2培养箱内37℃培养，2～3 d 传代1 次，取对数增殖期细胞用于后续实验。

1.2.2 细胞分组及干预转染前1 d，将HCT116 细胞按2×105个/孔接种于6 孔板中，置于体积分数5%二氧化碳CO2培养箱内37℃培养，待细胞贴壁后，参照LipofectamineTM2000 转染试剂说明书分别将miR-203 mimics 和 miR-203 mimics-NC 转染至HCT116 细胞，转染后培养24 h。根据转染和培养条件分组：对照组（5% CO2培养+未转染）、七氟醚组（4%七氟醚+5% CO2培养+未转染），miR-203组（5%CO2培养+转染miR-203 mimics）、miR-203+七氟醚组（4%七氟醚+5% CO2培养+转染miR-203 mimics），miR-203-NC+七氟醚组（4%七氟醚+5% CO2培养+转染miR-203 mimics-NC）。转染后24 h 后，置于荧光显微镜下观察，发出绿色荧光的为阳性细胞，随机选取20 个视野计数，计算转染效率。转染效率=阳性细胞数/细胞总数×100%。

1.2.3 CCK-8 实验检测细胞抑制率采用CCK-8实验检测细胞的增殖能力。各组细胞分别培养24 h、48 h、72 h，各个时间点结束前4 h，每孔加入10 μl CCK-8溶液，每组设置5个复孔，继续培养4 h后，加入DMSO 150 μl/孔，充分振荡10 min 后，用酶标仪在波长450 nm 处测定各孔光密度（OD）值，实验重复3 次，计算细胞抑制率。抑制率（%）=（1-实验组OD 值/对照组OD 值）×100%。

1.2.4 qRT-PCR 法检测miRNA-203 表达胰酶消化收集各组细胞，采用Trizol 试剂提取总RNA，分光光度仪检测所提RNA 的浓度和纯度，按照逆转录试剂盒逆转录cDNA，按照Real-time 定量PCR试剂盒说明书进行qRT-PCR 扩增。反应体系包括：正反向引物各1 μl，cDNA 模板1 μl，2×SYBR Green qPCR Master Mix 10 μl，加ddH2O至总体积20 μl。反应条件：95℃预变性10 min，95℃变性30 s，57℃退火30 s，70℃延伸30 s，循环40 次，分析熔解曲线，反应结束后计算Ct 值，实验重复3 次，取平均值。引物由上海吉玛公司设计合成，以U6为内参，采用2-△△Ct法计算miR-203 相对表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.2.5 细胞迁移能力检测将各组细胞以5×106个/ml 密度接种于6 孔板，当细胞融合达90%时，用无菌移液枪头在细胞表面垂直划线，弃去培养基，PBS 洗涤3 次后在划痕处拍照（0 h），更换培养基后放入培养箱继续培养，分别于12 h 和24 h 拍照，测量划痕间距，计算细胞迁移率。迁移率（%）=（0 h 划痕距离-各时间划痕距离）/0 h 划痕距离×100%。

1.2.6 细胞侵袭能力检测以1∶2 稀释的Matrigel基质胶铺于Transwell 小室上室，加入不含FBS 的DMEM 培养基，于培养箱中静置1 h。对细胞进行饥饿处理，密度调整为2×105个/ml，取200 μl 细胞悬液接种于Transwell 小室上室，下室加入500 μl含10%FBS 的DMEM 培养基，置于体积分数5%二氧化碳CO2培养箱37℃培养24 h，用棉签擦去上室多余细胞，每孔加入1 ml 多聚甲醛进行固定，固定30 min 后，用0.1%结晶紫染色30 min，吸去染色液，PBS 洗涤3 次，晾干后于显微镜下计数穿膜细胞量，以穿膜细胞数作为细胞侵袭力评价指标，每孔随机选取5 个视野，取平均数。

1.2.7 各组细胞ERK、p-ERK、MMP-9 蛋白相对表达量的检测收集各组细胞，加入Ripa 裂解液，冰上裂解，离心后收集上清，用BCA 法检测蛋白浓度并定量，蛋白样品与上样缓冲液混合，沸水浴加热使蛋白变性，配制10%聚丙烯酰胺凝胶，进行SDS-PAGE，转至PVDF 膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，分别加入稀释1∶500 的EPK、p-EPK、MMP-9、β-actin 一抗，4 ℃摇床孵育过夜，PBS 洗涤3 次，加入1∶2 000 稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育2 h，PBS 洗涤3 次，加入ECL 化学发光试剂，显影、定影，以β-actin 为内参，采用Image J 图像分析软件分析条带灰度值，目的蛋白相对表达量以目的蛋白条带灰度值/β-actin 条带灰度值表示。每组均设5 个复孔。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 21.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用单因素方差分析或重复测量设计的方差分析，进一步两两比较用LSD-t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞转染率

转染miR-203 mimics 和miR-203 mimics-NC 均有荧光表达，转染率≥85%，可用于后续实验。见图1。

图1 细胞转染效果 （×200）

2.2 各组细胞抑制率比较

七氟醚组、miR-203 组、miR-203+七氟醚组、miR-203-NC+七氟醚组细胞24 h、48 h、72 h 抑制率比较，采用重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点细胞抑制率有差异（F=49.586，P=0.000）；②各组细胞抑制率有差异（F=43.267，P=0.000）；③各组细胞抑制率变化趋势有差异（F=41.258，P=0.000）。见表2。

表2 各组细胞抑制率的比较 （n=5，%，±s）

表2 各组细胞抑制率的比较 （n=5，%，±s）

组别七氟醚组miR-203组miR-203+七氟醚组miR-203-NC+七氟醚组24 h 20.13±2.21 22.36±2.48 36.49±3.78 23.84±2.67 48 h 36.48±3.89 37.59±3.91 50.81±5.15 35.48±3.75 72 h 45.61±4.87 48.17±5.02 63.59±6.58 47.26±4.93

2.3 各组细胞的miRNA-203表达水平比较

对照组、七氟醚组、miR-203组、miR-203+七氟醚组、miR-203-NC+七氟醚组细胞的miRNA-203 相对表达量分别为：（0.52±0.07）、（1.75±0.18）、（1.78±0.18）、（2.35±0.25）和（1.71±0.17），经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=65.702，P=0.000）。七氟醚组、miR-203 组、miR-203+七氟醚组、miR-203-NC+七氟醚组细胞的miR-203 相对表达量较对照组升高，且以miR-203+七氟醚组最高（P＜0.05）；七氟醚组、miR-203组、miR-203-NC+七氟醚组细胞的miR-203 相对表达量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.4 各组细胞迁移率比较

各组细胞12 h 和24 h 迁移率比较，采用重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点细胞迁移率有差异（F=86.523，P=0.000）；②各组细胞迁移率有差异（F=64.158，P=0.000）；③各组细胞迁移率变化趋势有差异（F=102.557，P=0.000）。见表3 和图2。

表3 各组细胞迁移率比较 （n=5，%，±s）

表3 各组细胞迁移率比较 （n=5，%，±s）

组别对照组七氟醚组miR-203组miR-203+七氟醚组miR-203-NC+七氟醚组12 h 50.12±4.86 20.36±3.01 22.81±2.52 12.59±1.85 19.58±3.14 24 h 81.15±8.53 37.53±6.71 44.67±6.85 20.37±3.21 40.67±6.54

图2 各组细胞迁移距离比较 （×100）

2.5 各组细胞穿膜数量比较

对照组、七氟醚组、miR-203组、miR-203+七氟醚组、miR-203-NC+七氟醚组穿膜细胞数分别为（146.20±15.16）个、（82.40±10.01）个、（80.6±10.21）个、（35.20±4.13）个、（85.80±10.06）个，经单因素方差分析，各组穿膜细胞数量有差异（F=71.226，P=0.000）。七氟醚组、miR-203组、miR-203+七氟醚组、miR-203-NC+七氟醚组穿膜细胞数量均较对照组减少，且miR-203+七氟醚组穿膜细胞最少（P＜0.05）。七氟醚组、miR-203 组、miR-203-NC+七氟醚组穿膜细胞数量差异无统计学意义（P＞0.05）。见图3。

图3 各组细胞穿膜数量比较 （×200）

2.6 各组细胞ERK、p-ERK、MMP-9 蛋白相对表达量比较

各组细胞p-ERK、MMP-9 蛋白相对表达量有差异（F=80.679 和83.729，均P=0.000）。七氟醚组、miR-203 组、miR-203+七氟醚组、miR-203-NC+七氟醚组细胞p-ERK、MMP-9 蛋白相对表达量较对照组降低，且以miR-203+七氟醚组最低（P＜0.05）。七氟醚组、miR-203 组、miR-203-NC+七氟醚组细胞p-ERK、MMP-9 蛋白相对表达量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。各组ERK 蛋白相对表达量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4 和图4。

表4 各组细胞ERK、p-ERK、MMP-9蛋白相对表达量比较 （n=5，±s）

表4 各组细胞ERK、p-ERK、MMP-9蛋白相对表达量比较 （n=5，±s）

组别对照组七氟醚组miR-203组miR-203+七氟醚组miR-203-NC+七氟醚组ERK 1.03±0.11 1.10±0.12 1.05±0.11 1.07±0.12 1.11±0.12 p-ERK 0.95±0.10 0.46±0.05 0.45±0.05 0.28±0.03 0.49±0.06 MMP-9 1.08±0.11 0.51±0.05 0.53±0.06 0.34±0.04 0.55±0.06

图4 各组细胞ERK、p-ERK、MMP-9蛋白表达电泳图

3 讨论

手术是结直肠癌的主要治疗方法，但术后易转移、易复发、预后差，因此，研究探讨结直肠癌发生、发展机制对其诊断、治疗及预后有重要意义。七氟醚是临床肿瘤切除术中常用麻醉药，其对患者认知功能损害小，可有效改善患者术后血液流变学指标，降低手术引起的免疫抑制，降低血液黏稠度，减少血栓发生率[8-9]。基于七氟醚在结直肠癌中的生物学作用，本研究通过探讨七氟醚对结直肠癌侵袭、迁移机制的影响，以期为结直肠癌诊断、治疗及预后提供新途径，为提高患者生存率提供新的理论参考[10]。

侵袭和转移是肿瘤细胞显著的恶性生物学特征，是导致预后不良的主要因素，也是临床抗肿瘤治疗失败和导致患者死亡的主要原因。恶性肿瘤侵袭和转移是多种因素及多个基因相互调控的复杂过程，抑制肿瘤细胞侵袭和迁移对提高患者生存质量具有重要意义[11]。既往研究证实，七氟醚可抑制肿瘤细胞增殖及转移，在抗肿瘤方面显示独特作用，对患者生存率产生一定影响[12]。DING 等[13]研究发现，七氟醚通过靶向Ras 蛋白和靶向RhoA 蛋白抑制宫颈癌细胞增殖和迁移。KANG 等[14]研究显示，七氟醚通过调节JNK 和p38 MAPK 信号通路影响卵巢癌细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移。本研究七氟醚组细胞迁移率显著降低，穿膜细胞数量显著减少，表明七氟醚能抑制HCT116细胞侵袭和迁移。

CHI 等[15]研究显示，miR-203 可通过靶向下游相关基因抑制肺小细胞癌增殖和迁移。ZHANG 等[16]研究发现，miR-203 可通过调控RGS17 抑制前列腺癌细胞增殖、侵袭和迁移。本研究miR-203 组穿膜细胞显著减少、细胞迁移率显著下降，表明过表达miR-203 可抑制HCT116 细胞侵袭和迁移。研究发现，miR-203 在结直肠癌组织及细胞中的表达较正常结直肠组织、细胞异常降低，在结直肠癌发病过程中发挥重要调控作用，影响结直肠癌细胞增殖、侵袭和迁移[17]。本研究对照组miR-203 低表达，与以上研究结果一致，同时miR-203 组、miR-203+七氟醚组、miR-203-NC+七氟醚组miR-203 表达显著升高，其中miR-203+七氟醚组miR-203 表达更高，提示七氟醚可能对miR-203 有调控作用。CHEN 等[18]研究表明，七氟醚可通过调节miR-203 表达抑制人骨肉瘤细胞的增殖和侵袭。LIU等[19]研究发现，七氟醚可通过调节miR-203 表达抑制乳腺癌细胞增殖、侵袭和迁移。由此表明，七氟醚能抑制HCT116细胞侵袭和迁移，可能是通过调控miR-203 表达发挥抑制作用。

ERK 参与肿瘤增殖、凋亡、侵袭及迁移过程，是MAPK 信号通路之一，p-ERK 是衡量ERK 信号通路的活性指标，持续活化的ERK 通路有助于正常细胞向肿瘤表型转化。MMP-9 是重要蛋白水解酶，在多种肿瘤中表达，通过降解细胞外基质，增强细胞侵袭力和转移力，促进肿瘤细胞侵袭和迁移。ERK活化可激活下游MMP-9，提高肿瘤细胞侵袭转移能力。研究发现，阻断ERK 信号通路可以降低人骨肉瘤细胞活力，抑制其增殖、迁移、侵袭[20]。另有研究显示，荭草苷可以通过阻断ERK 信号通路下调MMP-9 表达来抑制乳腺癌细胞侵袭和迁移[21]。本研究七氟醚组、miR-203 组、miR-203+七氟醚组、miR-203-NC+七氟醚组p-ERK、MMP-9 蛋白水平显著下降，表明ERK 信号通路被阻断，从而影响HCT116 细胞侵袭和迁移。研究表明，miR-203 可以通过破坏ERK/MMP-9 信号轴抑制神经胶质瘤细胞迁移[22]。另有研究显示，在乳腺癌细胞中，小干扰RNA 通过升高miR-203 表达，下调MMP-9 表达抑制肿瘤细胞侵袭和迁移[23]。本研究miR-203+七氟醚组p-ERK、MMP-9 蛋白水平下降最显著，表明七氟醚对HCT116 细胞的抑制作用可能是通过上调miR-203表达，阻断ERK/MMP-9 通路，从而发挥抑制细胞侵袭和迁移作用。

综上所述，七氟醚有显著抑制人结直肠癌HCT116 细胞侵袭和迁移作用，其作用机制可能是通过上调miR-203 表达、阻断ERK/MMP-9 通路发挥调控作用，为临床诊治结直肠癌提供理论参考。