柴胡皂苷D基于PI3K/AKT/FoxO1调节神经炎症发挥抗抑郁作用

张 云，高 博，许海军

0 引言

抑郁症(Depression)是一类全球性的精神障碍性疾病[1]，发病机制复杂，临床研究显示，抑郁症患者血液、脑脊液及尸检脑中促炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α含量较高[2]，因此，神经炎症是现阶段抑郁症研究的重点。柴胡具有疏肝解郁、理气醒脑的功效，临床上常用其复方制剂治疗抑郁症[3]。近年来研究发现，柴胡中柴胡皂苷D能够通过调节炎症因子相关通路发挥抗抑郁作用，但其机制尚未完全阐明[4]。本研究拟诱导大鼠体内炎症反应，造成大鼠出现抑郁样行为，探究柴胡皂苷D对大鼠抑郁样行为的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器 柴胡皂苷D(Saikosaponin D，南京泽朗医药科技有限公司)；LY294002(PI3K特异性抑制剂，美国APExBIO公司)；BCA试剂盒、RIPA裂解液、5×上样缓冲液、β-actin抗体(上海碧云天生物科技公司)；IL-1β、IL-6、TNF-α试剂盒(南京建成生物公司)；PI3K抗体、p-Akt抗体、Akt抗体、p-FOXO1抗体、FOXO1抗体(北京博奥森生物公司)；TLR4抗体(美国Sigma生物公司)；ECL化学超敏发光液(南京天能生物公司)；开野实验、强迫游泳实验(北京众实迪创科技有限公司)；全波长酶标仪(美国Thermo公司)。

1.2 实验动物与分组 48只健康SPF级SD大鼠，体重180～200 g，由延安大学动物实验中心提供。适应性喂养1周后，随机分为对照组、模型组、柴胡皂苷D组、柴胡皂苷D+LY294002组。除造模期间，正常12 h/12 h日夜节律，温度(24±2) ℃，湿度50%～60%，自由饮水摄食，4只/笼。

1.3 实验造模与给药 参考文献[5]，构建LPS诱导抑郁动物模型并给药。所有大鼠随机分组后，柴胡皂苷D组与柴胡皂苷D+LY294002组灌胃给药柴胡皂苷D，剂量8 mg/kg。对照组与模型组灌胃生理盐水，剂量10 ml/kg。此外，柴胡皂苷D+LY294002组灌胃前1 h鼻滴LY294002溶液，剂量20 μg/kg。所有大鼠连续给予生理盐水或柴胡皂苷D 1周后，除对照组，其余各组腹腔注射LPS溶液，剂量1 mg/kg，连续腹腔注射5 d，治疗期间维持生理盐水、柴胡皂苷D、LY294002溶液给药。

1.4 行为学测试

1.4.1 糖水偏好实验 糖水偏好测试前，各组大鼠给予1瓶白水与1瓶1%蔗糖水饮用，适应一边白水、一边蔗糖水的情况。适应12 h后，所有大鼠单笼饲养，禁食禁水12 h。每只大鼠各给予1瓶白水与1瓶1%蔗糖水，称量实验两只水瓶重量。在大鼠饮用白水或蔗糖水12 h后，取下水瓶，再次称量水瓶重量，以2次水瓶重量记为大鼠白水或蔗糖水的消耗量，计算大鼠蔗糖水摄取率。计算公式：蔗糖水摄取率=蔗糖水消耗量/(白水消耗量+蔗糖水消耗量)。

1.4.2 强迫游泳实验 整个实验装置是一个直径60 cm的圆柱体，加入约40 cm的温水，距离水面40 cm处悬挂有一个摄像机。将大鼠投入水中，大鼠会在水中游泳并适应周围环境。在大鼠环境适应2 min后，摄像机记录大鼠在接下来4 min内在水中的游泳状态，通过强迫游泳分析软件计算出大鼠的游泳不动时间。不动标准：分析软件中大鼠物点维持不动(平移距离≤2 cm)3 s以上，计这段时间为强迫游泳不动时间。

1.4.3 开野实验 整个实验装置是一个边长160 cm的正方形旷场，中间用与背景颜色相似的线，平均划分为16个小正方形。距离宽敞底部约100 cm处悬挂有一个摄像分析仪，将各组大鼠依次投入旷场中，大鼠会在旷场中沿着四周跑动。在大鼠适应环境2 min后，摄像机记录大鼠在接下来4 min内的活动状态，通过旷场实验分析软件计算出大鼠穿格次数得分。计分标准：大鼠每穿过一格正方形计1分。

1.5 免疫组化检测 水合氯醛麻醉大鼠，打开胸腔，自心尖灌注PBS溶液，心耳流出血液，使用4%多聚甲醛固定组织。完整取出大脑组织，在4 ℃下浸入4%多聚甲醛中过夜，梯度脱水后进行石蜡包埋，切片(厚度约4～5 μm)，经脱蜡，水化处理后，放入抗原修复盒中，滴加5%BSA溶液，室温封闭30 min，染色并与抗TLR4抗体稀释液孵育过夜，将切片洗涤并在室温下与生物素化的山羊抗兔IgG孵育2 h，PBS溶液冲洗切片，滴加DAB试剂显色2～5 min，PBS冲洗终止反应，滴加苏木素溶液进行复染、盐酸酒精分化、反蓝、脱水并固定在载玻片上。应用光学显微镜收集海马CA1区的图像，使用Image Pro Plus扫描光密度值。

1.6 Western blot检测 水合氯醛麻醉大鼠，迅速断头取脑，镊取海马组织，使用RIPA裂解液裂解30 min后，匀浆后离心取上清液，BCA测蛋白含量，加入上样缓冲液后，沸水浴使蛋白变性。20 μg蛋白上样，SDS凝胶电泳结束后，脱脂牛奶封闭，洗净后一抗稀释液孵育过夜，次日孵育二抗并显影。使用Image J扫描条带灰度值。

1.7 炎性细胞因子检测 取大鼠海马组织，以质量∶体积=1∶4加入PBS溶液，匀浆后离心取上清液，根据IL-1β、IL-6、TNF-α、BCA试剂盒说明书进行操作，根据标准曲线，计算出各炎性细胞因子浓度和蛋白浓度，最后两者数据相比计算出海马组织中炎性细胞因子含量。

2 结果

2.1 柴胡皂苷D对LPS诱导大鼠行为学的影响 行为学结果反映了大鼠的抑郁样症状。糖水偏好实验反映了大鼠的喜感偏好，强迫游泳反映了大鼠的求生本能，开野实验反映了大鼠的空间探索欲望。如表1所示，与对照组相比，模型组大鼠糖水偏好率显著降低(P<0.05)，强迫游泳不动时间显著增加(P<0.05)，开野实验得分显著降低(P<0.05)。而柴胡皂苷D给药能够显著改善大鼠糖水摄取率(P<0.05)，减少强迫游泳不动时间(P<0.05)，增加开野实验得分(P<0.05)。此外，LY294002显著逆转了柴胡皂苷D对小鼠抑郁样症状的改善。

表1 各组大鼠行为学结果

2.2 柴胡皂苷D对LPS诱导大鼠脑中炎性细胞因子的影响 如表2所示，与对照组相比，LPS造成大鼠海马中IL-1β、IL-6及TNF-α等炎性细胞因子含量升高(P<0.05)；与模型组相比，柴胡皂苷D干预显著降低了脑中IL-1β、IL-6及TNF-α等炎性细胞因子含量(P<0.05)；LY294002提前干预显著升高了大鼠脑中IL-1β、IL-6及TNF-α等炎性细胞因子含量(P<0.05)。

表2 各组大鼠脑中炎症因子表达

2.3 柴胡皂苷D对LPS诱导大鼠海马CA1区神经元影响 如图1所示，对照组大鼠海马区CA1神经细胞排列整齐且数量众多，呈椭圆形或圆形分布，神经元轮廓清晰，界限分明；而模型组与柴胡皂苷D+LY294002组大鼠海马CA1区神经元细胞排列稀疏且数量较少，多数细胞形态破裂，轮廓不清，细胞核呈皱缩状态；然而，与模型组相比，柴胡皂苷D给药改善了大鼠海马CA1区神经元状态。

图1 各组大鼠海马CA1区神经元形态

2.4 柴胡皂苷D对LPS诱导大鼠海马CA1区TLR4蛋白影响 如图2、图3所示，与对照组相比，模型组大鼠海马CA1区神经元中TLR4蛋白染色较深，即TLR4蛋白表达增加(P<0.05)；与模型组相比，柴胡皂苷D组大鼠海马CA1区TLR4蛋白染色较浅(P<0.05)，而LY294002干预则显著增加了TLR4蛋白表达(P<0.05)。

图2 各组大鼠海马CA1区TLR4蛋白表达

图3 免疫组化中各组TLR4蛋白量化比较

2.5 柴胡皂苷D对LPS诱导大鼠海马中PI3K/AKT/FOXO1蛋白影响 如图4所示，与对照组相比，LPS显著增加了大鼠脑中PI3K蛋白表达，升高AKT蛋白、FOXO1蛋白磷酸化水平，差异均有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，柴胡皂苷D单独给药显著降低了PI3K蛋白表达，抑制了AKT蛋白、FOXO1蛋白磷酸化水平，差异均有统计学意义(P<0.05)；此外，PI3K蛋白特异性抑制剂则有效抑制了大鼠脑中PI3K蛋白表达，降低了AKT蛋白和FOXO1蛋白磷酸化水平，差异均有统计学意义(P<0.05)。

图4 各组大鼠海马中PI3K/AKT/FOXO1蛋白表达及量化比较

3 讨论

LPS诱导的动物抑郁模型是研究抑郁症经典模型，可以很好地模拟抑郁症患者体内炎症反应[6]。大量研究应用LPS腹腔注射或侧脑室注射，成功造成动物体内炎症反应增加，导致机体出现抑郁样症状[7]。本研究结果与文献报道一致，模型组大鼠行为学中糖水摄取率显著降低，提示大鼠喜感偏好丧失；模型组大鼠强迫游泳不动时间显著升高且开野实验得分降低，提示大鼠水中求生欲望丧失，空间探索欲望抑制，说明本次实验中LPS诱导大鼠抑郁样行为模型造模成功。本研究结果中，柴胡皂苷D提前干预有效升高了大鼠的糖水摄取率，减少了强迫游泳不动时间，增加了开野实验得分，且改善了大鼠脑中海马区神经元状态。然而，PI3K抑制剂的干预显著逆转了柴胡皂苷D对大鼠抑郁样行为的改善作用，提示柴胡皂苷D通过PI3K通路改善大鼠抑郁样行为。

TLR4是一种模式识别受体，不仅在免疫细胞中表达，而且大脑神经元、星型胶质细胞和小胶质细胞中也表达丰富。LPS在机体中可被TLR4特异性识别，并激活TLR4，介导其下游一系列炎症反应[8]。研究显示，海马中TLR4表达抑制可以减少其下游NF-κB活化并诱导一系列炎症反应，从而降低机体对抑郁的易感性，提示TLR4激活与抑郁样行为的发展密切相关[9]。本研究结果显示，模型组大鼠脑中TLR4蛋白表达升高，提示LPS成功激活TLR4，并介导其下游促炎细胞因子IL-1β、IL-6及TNF-α含量升高。柴胡皂苷D则有效改善了大鼠脑中TLR4蛋白激活，降低脑中促炎细胞因子水平，然而，PI3K抑制剂逆转了柴胡皂苷对TLR4蛋白激活，提示柴胡皂苷通过PI3K信号通路抑制大鼠脑中TLR4蛋白激活，改善大鼠脑中促炎细胞因子的释放。

PI3K/AKT信号通路中AKT的活化发生于蛋白生长因子与细胞表面的受体结合，诱导细胞质内受体部分酪氨酸的磷酸化，导致PI3K的聚集和活化[10]。PI3K/AKT信号在维持神经元的存活和功能方面起着重要作用[11]。PI3K/AKT信号通路的激活为TLR4介导的炎症反应提供了负反馈调节机制[12]。研究显示，黄芩苷在抑郁症模型中通过PI3K/AKT信号通路依赖的方式介导脑中神经炎症的减少，缓解小鼠抑郁样行为。此外，LY294002侧脑室注入小鼠脑中，介导脑中炎症反应增加，导致小鼠出现抑郁样行为。FOXO1是Fox转录因子家族中的一员，参与炎症反应的调节。研究表明，在免疫细胞中，FOXO1结合到TLR4基因的多个增强子原件，TLR4信号增强依赖于FOXO1活性，而FOXO1活性依赖于PI3K/AKT介导的磷酸化与去磷酸化[13]。PI3K/AKT信号通路的激活能够介导FOXO1磷酸化，p-FOXO1自细胞核中移位至细胞质中，失去对TLR4的转录调控活性[14]。本研究结果显示，LPS成功激活TLR4蛋白，抑制了PI3K/AKT信号通路，导致FOXO1磷酸化水平减少。而柴胡皂苷D则有效激活了PI3K/AKT信号通路，上调大鼠海马中p-AKT表达，p-AKT与FOXO1结合，促使FOXO1发生磷酸化，促进其发生核转位并降低FOXO1的转录调控活性，从而抑制了LPS诱导的大鼠海马中TLR4的表达。此外，LY294002的干预显著逆转了柴胡皂苷D对FOXO1介导的TLR4表达的影响，提示柴胡皂苷D作用的信号通路为PI3K/AKT信号通路。

综上所述，柴胡皂苷D通过PI3K/AKT信号通路，上调FOXO1磷酸化水平，抑制LPS介导的TLR4激活，改善大鼠脑中炎症因子的表达，缓解大鼠的抑郁样行为。