小檗碱介导的抗脑缺血凋亡通路研究进展

田 悦，王 奇，罗玉敏

0 引言

脑缺血具有高发病率、高死亡率、高致残率的特点，同时也给社会带来了巨大的经济负担，对人类健康造成了很大影响。在各种脑卒中疾病中，缺血性脑卒中所占比例超过80%[1-2]。其原因多是由于动脉管腔狭窄和血栓形成，以及血管痉挛等原因，进而引起大脑的缺血缺氧反应，患者多会出现偏瘫、偏身感觉障碍、偏盲、意识障碍等临床表现。当前，临床上多采用静脉溶栓疗法治疗脑缺血。重组组织纤溶酶原激活剂(Recombinant tissue-type plasminogen activator,r-tPA)具有可观的溶栓作用，是目前被批准使用的一类用于治疗急性脑缺血的药物，但该药必须在发病后3～4.5 h的治疗时间窗内应用方可达到理想疗效，临床上仅有少数患者能够接受该治疗。相比之下，对脑缺血患者进行相应的神经保护治疗显得至关重要[3-5]。脑缺血后的病理损伤，一般与细胞内钙离子失衡、兴奋性中毒、自由基介导的细胞毒性、炎症反应、神经元凋亡、血脑屏障破坏等有关，近年来在神经保护的基础实验中，研究方向大多与钙通道阻滞剂、N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂、自由基清除剂、抗炎药、抗凋亡剂、抗氧化剂等相关[6]。有文献报道，在脑缺血后进行神经保护治疗，可减少神经元细胞的死亡，延长治疗时间窗[7]。传统的神经保护治疗一般采用单一机制干涉，无法从多方面干预脑缺血患者的病理生理级联反应[8]。而且由于人与实验动物大脑结构功能的差异性、临床治疗时间窗的限制、临床治疗期间血药浓度的差异性、临床实验观察指标的差异性及临床实验的设计缺陷等因素，神经保护药物在基础医学研究阶段有一定疗效，但在临床实验中则鲜有成功[6]。因此，目前尚无有效的神经保护药物可应用于临床。随着对脑缺血研究的深入，迫切需要新的治疗药物以延长治疗时间窗，减少神经元丢失，促进脑缺血后神经功能的恢复。近年有研究表明，利用小檗碱对脑缺血动物模型进行干预，能够显著减少脑梗死体积，减轻脑水肿，发挥神经保护作用[9]。

小檗碱，又名黄连素，是从传统中药黄连中提取出的一种季胺型异喹啉生物碱。近年研究表明，小檗碱具有良好的抗肿瘤、降血脂、治疗糖尿病、抗动脉粥样硬化、抗脑缺血、神经保护、抗炎、抗凋亡等作用[10-15]。本综述总结了近年来研究发现的小檗碱抗脑缺血凋亡相关通路及相关机制，为进一步研究小檗碱的抗脑缺血作用提供思路。

1 脑缺血后的细胞死亡方式

脑缺血会导致缺血核心区的神经元细胞死亡，同时，缺血半暗带区的神经元也受到相应的损伤，随着时间的推移亦会逐渐死亡[16]。随着缺血后再灌注的恢复，将会为大脑带来更加严重的损害，称为缺血/再灌注损伤[17]。一系列的反应，均会引起神经功能的进一步损伤[18-19]。因此，脑缺血后，神经元细胞多是以死亡而告终。常见的细胞死亡方式有坏死、凋亡、坏死性凋亡、细胞焦亡、自噬性细胞死亡、铁死亡等[20-21]。但在脑细胞的众多死亡方式中，目前研究最多的是神经元凋亡。

2 小檗碱对凋亡相关基因的影响

脑缺血发生后，会引发一系列的炎症反应，导致神经元细胞损伤，而神经元细胞的损伤则进一步加剧了神经元凋亡，如何保护缺血区与缺血半暗带区的神经元细胞免受凋亡，促进大脑神经功能恢复，发挥脑保护作用，是治疗脑缺血的关键点[22]。细胞凋亡是指在各种刺激下诱导的、受基因调控的程序性死亡，具有主动耗能的特点[23]。神经元细胞凋亡涉及众多凋亡相关基因，研究较多的为B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白(Bax)与半胱氨酰天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)。其中，Bcl-2是重要的抗凋亡相关基因，Bax为促凋亡基因[24-27]。Caspase-3为凋亡执行的关键因子[28-30]。本综述以小檗碱影响抗凋亡基因为切入点，论述小檗碱的神经保护作用。

3 小檗碱对脑缺血凋亡通路的影响

3.1 小檗碱通过Akt/GSK3β/ERK抗凋亡信号通路发挥神经保护作用 蛋白激酶B(Akt)是一种由生长因子调控的丝氨酸/苏氨酸激酶，磷酸化的Akt具有抗凋亡作用[31-32]。丝氨酸/苏氨酸糖原合成酶激酶-3(GSK3β)在中枢神经系统中含量丰富，磷酸化GSK3β对神经细胞具有各种调节功能[33]。细胞外调节蛋白激酶(ERK)为丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族成员[34]，磷酸化ERK能够发挥相应的神经保护作用[35]。在中枢神经系统疾病中，磷酸化Akt/GSK3β/ERK可以通过抑制Caspase-3的表达，减少细胞凋亡，进而发挥抗凋亡作用[36-37]。同时，磷酸化Akt/GSK3β/ERK，能够减少神经毒性，保护神经元细胞，发挥相应的神经保护作用[38-40]。

有研究采用荧光图像分析碘化丙啶(PI)摄取来评估缺氧缺糖(OGD)处理的脑缺血大鼠细胞损伤，通过Western blot分析Akt、GSK3β、ERK和JNK在脑缺血大鼠脑内的表达，借助荧光底物Ac-DEVD-AFC裂解法测定Caspase-3活性。结果发现，大鼠脑缺血后磷酸化Akt(p-Akt)、磷酸化GSK3β(p-GSK3β)及磷酸化ERK(p-ERK)表达显著减少，Akt、GSK3β及ERK表达显著增加，大鼠脑内Caspase-3活性增高，细胞凋亡增多，而小檗碱则能够逆转这一现象。同时，小檗碱治疗后，PI摄取减少，证明细胞凋亡减少，该研究表明，小檗碱可以通过抑制大鼠脑缺血后Caspase-3的活性表达，减少细胞凋亡，发挥神经保护作用，且该作用涉及Akt/GSK3β/ERK信号通路[41]。

Zhang等[42]采用Longa评分法[43]对永久性大脑中动脉闭塞(pMCAO)脑缺血大鼠进行神经功能缺损评分，用标准干/湿重法测定脑含水量，采用TTC染色法测定大鼠脑缺血后梗死体积，采用免疫组化法测定大鼠脑缺血后脑内p-GSK3β、p-Akt的表达，采用Western blot法测定大鼠脑缺血后脑内Akt、p-Akt、GSK3β及p-GSK3β的表达。结果显示，小檗碱治疗能够显著降低大鼠神经功能缺损评分，发挥神经保护作用，显著降低大鼠脑含水量与脑梗死体积，显著上调p-GSK3β、p-Akt的表达，该研究表明小檗碱对缺血性神经损伤的保护作用涉及Akt/GSK3β信号通路。

3.2 小檗碱通过PI3K/Akt抗凋亡信号通路发挥神经保护作用 磷酸肌醇3激酶(PI3K)是一种胞内磷脂酰肌醇激酶，PI3K本身具有丝氨酸/苏氨酸激酶的活性，也具有磷脂酰肌醇激酶的活性，磷酸化PI3K具有神经保护作用[44]。

在蒙古沙鼠脑缺血研究中，Kim等[45]以跳台回避任务实验评估短暂性全脑缺血沙鼠的短期记忆，采用免疫组化法测定沙鼠全脑缺血后Caspase-3的表达，利用Western blot分析测定沙鼠全脑缺血后PI3K、Akt、Bax、Bcl-2的表达。研究结果发现，脑缺血导致沙鼠短期记忆功能显著下降，使其海马磷酸化PI3K(p-PI3K)及p-Akt表达显著减少，PI3K以及Akt表达显著增多，同时，蒙古沙鼠脑海马区的Caspase-3与Bax表达显著升高，Bcl-2表达显著减少，而小檗碱治疗可以显著减轻缺血诱导的沙鼠短期记忆功能损害，逆转凋亡相关因子Bax、Bcl-2及Caspase-3的表达，增加PI3K与Akt的磷酸化表达，发挥神经保护作用。该研究表明,小檗碱通过激活PI3K/Akt信号通路抑制神经元凋亡，发挥其抗缺血性损伤的神经保护作用。

在大鼠脑缺血研究中，Hu等[46]采用PC12细胞与大鼠脑海马的原代神经元缺氧缺糖处理方式，用MTT法测定小檗碱对PC12细胞缺氧缺糖的保护作用，用流式细胞术分析细胞凋亡，借助Western blot检测缺氧缺糖处理PC12细胞后p-Akt、总Akt和Caspase-3下游凋亡信号的时间依赖性变化，同时，测定双侧颈总动脉缺血再灌注模型大鼠脑内p-Akt以及Caspase-3的表达，利用实时逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测PI3K 与PI3K调节亚单位p55γ的mRNA水平。结果显示，小檗碱以剂量依赖的方式显著提高了细胞活力与细胞存活率，显著降低了细胞Caspase-3的积累，促进Akt磷酸化，上调了PI3K调节亚单位p55γ的表达。同时，小檗碱的治疗可显著上调脑缺血再灌注大鼠脑内p-Akt的表达，抑制Caspase-3的表达。在使用PI3K抑制剂Ly294002与Akt抑制剂Akti-1/2后，小檗碱的细胞保护作用则被抑制，该研究表明，小檗碱通过PI3K/Akt信号通路发挥神经保护作用。

3.3 小檗碱通过SIRT1抗凋亡信号通路发挥神经保护作用 沉默信息调节因子2相关酶-1(SIRT1)在中枢神经系统中具有重要的保护作用，有研究表明，脑缺血后，SIRT1受到抑制，使其抗凋亡作用减弱，而激活SIRT1后，则能够发挥相应的神经保护作用[47-49]。

为探讨小檗碱预处理对脑缺血大鼠的影响，王博等[50]采用Longa 评分法对脑缺血再灌注大鼠进行神经功能缺损评分，采用Western blot检测大鼠脑缺血再灌注后大脑内Bcl-2、Bax以及Caspase-3的表达，研究结果显示，接受小檗碱预处理的脑缺血再灌注大鼠，神经功能缺损评分显著下降，大鼠脑组织中 Bcl-2 的表达显著增多，Bax与Caspase-3的表达显著减少，表明小檗碱能够抑制大鼠脑缺血再灌注损伤过程中的细胞凋亡。在联合使用 SIRT1 抑制剂 EX527 后，发现小檗碱对凋亡相关基因Bcl-2、Bax及Caspase-3的作用被抑制。该研究提示，小檗碱能够抑制脑缺血再灌注过程中的细胞凋亡，发挥神经保护作用，而该过程涉及SIRT1抗凋亡通路。

3.4 小檗碱通过HIF-1与p53抗凋亡信号通路发挥神经保护作用 缺氧诱导因子-1(HIF-1)是一种转录因子，是氧稳态的重要调节因子。Chen等[51]研究发现，缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)能够在体外直接结合mdm2癌基因，但却不能与p53抑癌基因在体外直接结合。不过，mdm2表达可以显著增强p53和HIF-1α在体内结合，表明mdm2可能在HIF-1α与p53之间起到桥梁作用，促进二者在细胞中相互作用。同时，HIF-1可以增加p53的稳定性，HIF-1能够通过与p53泛素连接酶mdm2结合来调节Bax等凋亡相关蛋白，从而诱导程序性细胞凋亡。此外，在中枢神经系统中，p53的表达具有促凋亡作用，而抑制其表达，则是发挥神经保护作用的关键点[52]。

Zhang等[53]采用Western blot检测大鼠大脑中动脉闭塞后脑组织内HIF-1α及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3的表达，采用TUNEL检测法和免疫组织化学法检测大鼠大脑中动脉闭塞后脑组织细胞凋亡程度与HIF-1α及p53的表达。结果发现，脑缺血后大鼠脑内HIF-1α和p53表达显著增多，而小檗碱可以显著逆转这一现象。同时，小檗碱预处理也显著降低了大鼠脑缺血后脑组织内细胞凋亡程度，显著增加了Bcl-2的表达，减少了Bax与Caspase-3的表达。该研究表明小檗碱能够通过下调HIF-1α和p53的表达，进而抑制大鼠脑缺血后神经元凋亡，发挥神经保护作用。

4 小结

综上所述，小檗碱主要通过Akt/GSK3β/ERK、PI3K/Akt、SIRT1、HIF-1/p53信号通路，影响凋亡相关基因，增加Bcl-2的表达[45,50,53]，减少Bax的表达[45,50,53]，抑制Caspase-3的表达[41,45-46,50,53]，从而发挥相应的神经保护作用。

目前，脑缺血仍是威胁人类生命安全的医学难题，寻找对脑缺血患者更好的神经保护治疗方法，是众多科学家努力的方向。小檗碱可能成为一种神经保护候选药，其改善血脑屏障通透性的特性，使其在脑缺血神经保护方面具有巨大的潜力[42]。研究发现，经小檗碱预处理的脑缺血模型，能够显示出预防脑缺血、保护神经元免受缺血缺氧损害、改善神经功能缺损的良好作用[54-55]。同时，小檗碱所具有的良好的抗神经元细胞凋亡作用，使其在神经保护方面具有更大的优势。此外，研究发现，正常剂量下小檗碱具有很小的毒性与副作用[56]。因此，将小檗碱作为抗脑缺血的理想药物，可能会发挥良好的神经保护作用。但目前对小檗碱的认识还不够全面，小檗碱还有更多的药理作用亟待研究与开发，如何让小檗碱以最佳的抗凋亡通路发挥神经保护作用并保证其安全性，还需要在今后的研究中进一步探索。