连续动态逆流提取对香菇多糖抗氧化活性的影响

李德灵，林锦铭，陈海平，黎 攀，张全才，杜 冰

（1，无限极（中国）有限公司，广州 510623；2，华南农业大学 食品学院，广州 510642）

0 引言

香菇（Lentinus edodes）属真菌门［1］，富含多糖、蛋白质、氨基酸等多种活性成分，具有一定的食疗与药疗效果，是我国最常见的食用菌之一［2］。据报道，香菇多糖具有抗氧化、抗肿瘤、调节免疫、抗炎及抗衰老等多种生理活性［3-7］，在食品和医药等方面有非常广阔的应用前景。目前提取香菇多糖的方法主要有热水浸提法［8］、酸提取法和碱提取法［9-10］。热水浸提法是在高温条件下香菇细胞吸水膨胀破碎，香菇多糖从细胞内扩散到溶剂中从而提取香菇多糖，是提取多糖最常见的一种方法。该方法成本低、工艺操作简单，被广泛应用于工业化生产。而酸提取法和碱提取法，虽然在一定程度上能够提高粗多糖提取率，但需要引入大量的有机试剂，容易对环境造成污染，而且容易破坏多糖的生物活性。同时，运用超声波、微波、酶法等技术手段辅助提取多糖［11-13］，也可以从一定程度上提高粗多糖得率，但其成本高、耗时耗能，在工业化运用方面较少，此外微波作用于有机溶剂容易引发试验潜在的危险［14］。因此，寻找一种提取率高、提取时间短、节能环保、操作简便的提取方法已迫在眉睫。

动态逆流提取技术（DCE）能够充分利用系统中固液两相的浓度梯度［15-16］，使提取液出料时达到更高浓度的平衡［17］。这不仅可以提高被提取物的提取率，还能节约能耗、缩短提取时间［18］，满足了部分原料功能成分的高效提取需求。目前，该技术研究主要集中在动态逆流提取工艺条件的优化［19-21］，主要应用于药品功能成分的提取［22］，在香菇多糖的提取应用方面还未见报道。因此，本研究将动态逆流提取技术运用于香菇多糖的提取，并研究其对香菇多糖提取率及抗氧化能力的影响。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

香菇（无限极（中国）有限公司）；2，4，6-三吡啶基三嗪、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），Aladdin；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、铁氰化钾、三氯乙酸、硫酸亚铁、苯酚、水杨酸、葡萄糖等均为分析纯（天津市大茂化学试剂厂）。

动态逆流设备（江苏华泰制药机械有限公司）；电子天平ME204E（梅特勒-托利多公司）；UV-3802紫外分光光度计（上海仪田精密仪器有限公司）；HH-S6型电热恒温水浴锅（常州市万丰仪器制造有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 总糖含量的测定

香菇多糖的含量采用苯酚-硫酸法［23］进行测定，试验得总糖标准曲线回归方程为：Y=44.234 42x+0.022，R=0.999，线性关系良好。其中，x表示质量浓度（mg/mL），y表示吸光度。

1.2.2 香菇多糖的提取

将香菇于60 ℃干燥至恒重，然后进行粉碎，过40目筛制得香菇粉备用。将动态逆流提取罐机组串联，精密称取200 g香菇粉于罐组式动态逆流提取仪中，然后加入4 L蒸馏水（料液比1：20）90 ℃提取香菇多糖，提取时间为 2 h，提取溶剂沿原料溶质浓度由低向高输送经过各罐并多次套用［24］。动态平衡后，在 0 min、20 min和 40 min取样，冷却抽滤后于55 ℃旋转蒸发仪中进行浓缩［25］，得到的滤液定容至 100 mL。

Sevag法［26］脱去蛋白后用4倍体积的乙醇醇沉过夜，经离心后将沉淀复溶并冷冻干燥得到香菇多糖。其他条件相同，以相同质量的香菇原料运用热水回流法提取得到香菇多糖为对照组。其他条件一致，以同等质量的香菇样品，用热水提取法提取的香菇多糖溶液作为对照组。

1.2.3 多糖抗氧化能力的测定

香菇多糖的抗氧化能力通过检测多糖对O2-、·OH、DPPH自由基清除能力以及铁离子的还原能力进行测定。其中O2-·、·OH和DPPH自由基清除能力分别采用邻苯三酚法［27］、Fenton法和Kamble P等的方法进行测定［28-29］，并参照韩洪坤等［30］的方法对铁原子还原能力进行测定。

1.3 数据处理

试验数据采用Microsoft Excel 2016处理，用SPASS 19.0进行分析。

2 结果与讨论

2.1 连续动态逆流提取方法对香菇多糖得率的影响

2.1.1 动态逆流提取对提取液多糖浓度的影响

从图1可以看出，连续动态逆流提取的香菇多糖浓度显著高于对照组（3.23 mg/mL），连续动态逆流提取平衡后20 min所得香菇提取液的多糖浓度最高为5.70 mg/mL，较动态逆流平衡后0 min（5.03 mg/mL）和 40min（5.55 mg/mL）所得多糖浓度高。这可能是因为连续动态逆流提取香菇多糖过程中，溶剂存在连续的浓度梯度，使得多糖充分向外扩散，提取液多糖浓度较高［31］。因此，运用连续动态逆流提取法提取香菇多糖可以显著提高多糖溶出率。

图1 动态逆流提取对香菇多糖提取液浓度的影响Fig.1 Effect of dynamic countercurrent extraction on the concentration of lentinus edodes polysaccharide extract

2.1.2 动态逆流提取对香菇多糖得率的影响

由图2可知，运用连续动态逆流提取法的香菇得率显著高于对照组（3.20%），其中连续动态逆流提取平衡后20 min所得香菇多糖提取率为8.43%，且明显高于平衡后0 min（7.86%）和40min（8.07%）的香菇多糖得率。综上可知，采用连续动态逆流法提取香菇多糖得率显著高于热水回流法，这可能是因为连续动态逆流提取充分利用了香菇粉和蒸馏水两相的浓度梯度，逐级将多糖扩散至起始浓度较低的套提溶液中［32］，从而提高香菇多糖得率。此外，平衡后40 min取样的多糖得率稍微下降，可能是随着时间的延长，其他水溶性杂质溶于溶剂的量增大［33］。因此，选用连续动态逆流提取平衡后20 min抽滤浓缩后制得香菇多糖，并进一步探究其抗氧化能力。

图2 动态逆流提取对香菇多糖得率的影响Fig.2 Effect of dynamic countercurrent extraction on the yield of lentinus edodes polysaccharide

2.2 动态逆流提取对香菇多糖抗氧化能力的影响

2.2.1 动态逆流提取对羟自由基清除率的影响

多糖的抗氧化作用通常用羟自由基清除能力来评估，羟自由基会引起赖氨酸迅速损伤，诱发疾病。由图3可见，两种工艺提取的香菇多糖羟自由基清除率都随香菇多糖浓度的增大而增大，动态逆流提取法所得香菇多糖对羟自由基的清除能力显著高于热水回流法得到的香菇多糖羟自由基清除率。动态逆流提取的香菇多糖浓度在1 mg/mL到1.5 mg/mL逐渐增大时，香菇多糖羟自由基清除率显著增大。

图3 动态逆流提取对香菇多糖羟自由基清除率的影响Fig.3 Effect of dynamic countercurrent extraction on scavenging rate of hydroxyl radical of Lentinus edodes polysaccharide

2.2.2 动态逆流提取对超氧自由基清除率的影响

动态逆流提取对香菇多糖超氧自由基清除率的影响如图4所示。

由图4可见，连续动态逆流提取的香菇多糖对超氧自由基清除率明显高于普通热水回流法提取的香菇多糖自由基清除率，两种工艺提取的香菇多糖对超氧自由基的清除率都随香菇多糖浓度增大而增大。当连续动态逆流提取的香菇多糖浓度从0.5 mg/mL增加到1.5 mg/mL时，香菇多糖对超氧自由基的清除率显著增加。

2.2.3 动态逆流提取对DPPH自由基清除率的影响

超氧自由基的生成和清除的平衡对于机体维持正常的生理活动具有重要意义。由图5可见，在香菇多糖浓度为0.5 mg/mL到1.5 mg/mL的浓度范围内，采用动态逆流提取工艺提取的香菇多糖对DPPH自由清除率比一般的热水回流提取的香菇多糖高，浓度超过1.5 mg/mL时，二者对DPPH自由清除率接近。说明动态逆流提取得到的香菇多糖相对热水回流提取得到的香菇多糖在多糖浓度较低时（0.5～1.5 mg/mL）具有更强的DPPH自由基清除能力。二者对DDPH自由基清除率均随香菇多糖浓度增大而增大。

2.2.4 动态逆流提取对Fe还原力的影响

由图6可见，两种提取方法得到的香菇多糖抗氧化能力均随多糖浓度的增大而增大。在香菇多糖浓度为0.1 mg/mL到0.5 mg/mL的浓度范围内，采用动态逆流提取工艺提取的香菇多糖对Fe还原力比一般的热水回流提取的香菇多糖高，连续动态逆流提取所得香菇多糖抗氧化能力更强。

3 结语

连续动态逆流提取法提取的香菇多糖得率及其抗氧化能力均显著高于普通热水回流法提取的香菇多糖。香菇多糖质量浓度为1.5 mg/mL时，连续动态逆流提取法提取的香菇多糖对O2-·、·OH和DPPH·清除率分别为71.35%、78.36%和70.36%，比热水回流提取的香菇多糖提高了38.75%，52.36%和36.82%。同时，采用动态逆流提取的方法不用引入高压和超声设备，成本较低、工艺操作简单、提取时间较短，在工业化应用方面有广阔的前景。综上，将连续动态逆流提取应用于香菇等植物的活性成分提取具有重要意义。