花叶滇苦菜黄酮对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除活性研究

宋彦显，闵玉涛，陈 静

（郑州工程技术学院，郑州 450044）

0 引言

花叶滇苦菜（Sonchus asper （L.） Hill）又名续断菊，苦马菜，属被子植物门，双子叶植物纲，桔梗目，菊科，苦苣菜属，在我国被列为一般入侵植物，花叶滇苦菜生长繁殖能力强，在我国分布广，资源丰富，是深受欢迎的野生蔬菜之一［1］。花叶滇苦菜营养丰富，且具有多种生物活性和药效。Kamble Sanghmitra S.等［2］研究发现花叶滇苦菜正己烷提取物具有较好的抗贫血效果。Rahmat Ali Khan，PhD［3］研究发现花叶滇苦菜提取物可以显著减轻糖尿病大鼠症状，具有降糖活性潜质。Mushtaq Muhammad Naveed 等［4］研究发现花叶滇苦菜水-甲醇提取物有显著的抗高血压活性，可以开发植物降压药。陈睿等［5］试验结果表明，花叶滇苦菜总黄酮提取液乙酸乙酯萃取物对金黄色葡萄球菌具有一定的抑制作用。

苦苣菜属植物含有大量的黄酮类物质，刘丽敏等［6］研究微波辅助提取苦苣总黄酮得率23.8 mg/g。刘婧等［7］采用超声波破碎法提取长裂苦苣菜总黄酮提取率可达28.57 mg/g。陈睿等采用微波辐射预处理提取花叶滇苦菜总黄酮提取率地上部分38.328 mg/g和地下部分7.232 mg/g。近年来，研究发现苦苣菜属黄酮类物质，具有抗氧化活性及清除自由基的能力，抗抗溃疡和溃疡性结肠炎、抗衰老的功效［8-10］。但目前，花叶滇苦菜黄酮抗氧化活性的研究国内尚未见报道。

本文以花叶滇苦菜为试验原材料，用乙醇提取黄酮，经乙酸乙酯萃取进行初步纯化，采用DPPH自由基清除法测定其抗氧化活性，为花叶滇苦菜资源的综合利用和天然抗氧化剂的开发提供参考和理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

花叶滇苦菜，采自郑州市贾鲁河附近。

芦丁（标准品，南京奥多福尼生物科技有限公司）；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）（分析纯，合肥巴斯夫生物科技有限公司）；乙酸乙酯（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；亚硝酸钠（分析纯，天津市致远化学试剂有限公司）；硝酸铝（分析纯，南京化学试剂股份有限公司）；其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

UV-1800PC DS2型紫外可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）；DZF-6050真空干燥箱（上海山连实验设备有限公司）；旋转蒸发仪（巩义市予华仪器有限责任公司）；恒温水浴锅（金坛市正基仪器有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 芦丁标准曲线的制备

准确称取芦丁标准品10 mg，用60%的乙醇溶解后，定容至50 mL的容量瓶中，即得到0.2 mg/mL的芦丁标准储备液。分别吸取0、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL、6.00 mL 于 7个 15 mL的刻度试管中，先加入5%的亚硝酸钠溶液0.4 mL，摇匀后静置6 min。再加入10%的硝酸铝溶液8.0 mL，摇匀后静置6 min。最后加入4%的氢氧化钠溶液8.0 mL，摇匀后，加60%的乙醇溶液定容至8 mL，静置10 min。在510 nm波长处测定其吸光度值，以芦丁的浓度为横坐标，吸光度（Abs）为纵坐标，制备标准曲线

1.3.2 花叶滇苦菜黄酮粗提取物的制备

花叶滇苦菜洗净后，晾干烘烤，粉碎过40目筛，得花叶滇苦菜的粉末。称取20 g的花叶滇苦菜粉末，用200 mL的80%乙醇，在温度为80 ℃的条件下回流提取3次，真空泵抽滤2 h，合并滤液，用旋转蒸发仪减压浓缩后，得花叶滇苦菜黄酮乙醇粗提物，测定得率。

1.3.3 花叶滇苦菜黄酮提取物的制备

将花叶滇苦菜黄酮乙醇粗提物加入乙酸乙酯进行萃取，萃取6次以上，合并上清液，50～60 ℃旋转蒸发仪蒸发浓缩，调pH值在3～4之间，在用石油醚萃取除色素，蒸发浓缩后即得花叶滇苦菜黄酮提取物，计算得率。

1.3.4 花叶滇苦菜的黄酮提取率的计算

分别吸取2 mL的萃取前和萃取后的花叶滇苦菜提取物，按照1.3.1方法在510 nm下测定吸光度值，根据标准曲线和回归方程，计算萃取前和萃取后花叶滇苦菜的黄酮含量，按照下式分别计算提取率。

花叶滇苦菜黄酮提取率（mg/g）=CVn/M

式中 C——样液经吸光度算出的原提取液中总黄酮的质量浓度，mg/mL；

V——提取液总体积，mL；

n——稀释倍数；

M——称取的花叶滇苦菜质量，g。

1.3.5 花叶滇苦菜的黄酮提取液对DPPH自由基清除试验

采用马庆一等［11］的研究方法，原花叶滇苦菜黄酮提取液浓度为5.5 mg/mL，分别配制成0.5、1.5、2.5、3.5、4.5、5.5 mg/mL 5 种浓度，每个浓度配制5 mL，配制如表1。

取三支试管并依次编号，于试管①中加入2 mL的无水乙醇，和2 mL一定浓度的花叶滇苦菜黄酮提取液，于试管②中加入2 mL的一定浓度花叶滇苦菜黄酮提取溶液和2 mL DPPH溶液，于试管③中加入2 mL的DPPH溶液和2 mL的无水乙醇，分别摇匀后置于25 ℃水浴中保持30 min，以试管①做为调零管，用分光光度计于517 nm下测定试管②和试管③的吸光度值，分别记为A样品和A空白。

抑制率计算公式：

抑制率=（A空白-A样品）/A空白×100%

1.3.6 花叶滇苦菜黄酮提取物、BHT、VC对DPPH自由基清除能力的比较

BHT母液配制：称取275 mgBHT，用乙醇溶解后定容至50 mL容量瓶中，配制成浓度为5.5 mg/mL的BHT溶液。

Vc母液配制：称取275 mg的维生素C，用乙醇溶解后，定容至50 mL的容量瓶中，配制成浓度为5.5 mg/mL的维生素C溶液。

将 BHT 和 Vc分别稀释成 0.5、1.5、2.5、3.5、4.5、5.5mg/mL 6种浓度如表2所示。按照1.2.5的方法检测其清除DPPH自由基的能力。

表2 BHT和Vc溶液稀释Table 2 Dilution table of BHT and Vc

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线的制作

在分光光度计波长为510 nm处测定其吸光度以芦丁的浓度为横坐标，吸光度（Abs）为纵坐标，绘制得到标准曲线如图1所示。

图1 芦丁标准曲线Fig.1 Rutin standard curve

由图1可知，回归方程y=6.366 9x-0.003 1，回归系数R2=0.998 5，在芦丁浓度0～0.15 mg/mL范围内，具有很好的线性关系。

2.2 花叶滇苦菜黄酮的提取

采用回流-乙醇提取法制备黄酮提取率为11.5%，石油醚脱色、乙酸乙酯萃取后黄酮提取率4.8%，萃取后的黄酮类化合物有所损失，但纯度更高。第一次提取过程中使用的95%乙醇，后换成80%的乙醇，提取结束后，用乙酸乙酯进行萃取，萃取后测定其吸光度值，发现花叶滇苦菜黄酮提取液颜色对试验结果干扰较大，即用旋转蒸发仪把乙酸乙酯蒸发后，用石油醚进行除色处理，除色处理后再次萃取，然后再吸光度值测定，减少误差。萃取前的黄酮类化合物得率为，萃取后黄酮类化合物提取率为。

植物源黄酮的提取方法多样，为使得黄酮提取率更高，本文采取回流-乙醇提取法。这是一种比较温和的提取方法，能够完整的使黄酮溶解，并能提高它的得率和保护它的生物活性。为进一步测定黄酮得率和研究抗氧化活性奠定了良好的基础。

2.3 花叶滇苦菜黄酮提取物对DPPH自由基的清除能力的测定

将花叶滇苦菜黄酮提取物配制成6个浓度，分别测定不同浓度下对DPPH自由基的清除能力，结果如图2所示。

图2 花叶滇苦菜黄酮提取液清除DPPH自由基的能力Fig.2 DPPH radical scavenging ability of flavone extract from Sonchus asper

DPPH自由基即二苯基苦酰肼基自由基，是一种稳定的氮中心自由基，常用于体外抗氧化活性的评价［12］。从图2可知，不同浓度的提取物都具有清除自由基的能力，对DPPH自由基清除能力随着花叶滇苦菜黄酮提取液浓度增大而增强，且呈上升趋势，当样品浓度达到1.5 mg/mL时，对DPPH自由基清除能力明显增强，并开始逐渐趋于平稳，测定结果显示，当浓度为5.5 mg/mL时，样品对DPPH自由基的抑制率高达94.12%，试验结果表明，花叶滇苦菜黄酮类化合物具有很强的抗氧化能力。

2.4 花叶滇苦菜黄酮提取物、BHT、VC对DPPH自由基清除能力的比较

将花叶滇苦菜黄酮提取物、BHT、VC分别配制成6个相同浓度，分别测定不同浓度下对DPPH自由基的清除能力如图3所示。

图3 花叶滇苦菜黄酮提取液、BHT、Vc对DPPH自由基清除能力的比较Fig.3 Comparison of DPPH free radical scavenging ability of flavone extract of Sonchus asper，BHT and Vc

BHT是一种人工合成抗氧化剂，且是一种油溶性抗氧化剂，这里为了做单因素对照试验，所以溶剂选用了无水乙醇。从结果可以看出，抗氧化活性不如花叶滇苦菜黄酮类化合物高。在5.5 mg/mL时，BHT对DPPH自由基的抑制率达80.10%。

Vc是具有强抗氧化活性的抗氧化剂，常作抗氧化研究的对照品［13］。从图3可以看出，Vc的抗氧化活性很强，当Vc溶液的浓度达到0.5 mg/mL时，对DPPH自由基抑制率高达到97.05%，随着Vc的浓度增大，对DPPH自由基清除能力明显增强，在5.5 mg/mL时Vc对DPPH自由基的抑制率高达98.75%。说明Vc的抗氧化活性很强。

比较可知，花叶滇苦菜提取液黄酮的浓度与DPPH自由基清除能力呈正相关。经过不同浓度梯度稀释，花叶滇苦菜黄酮提取物，BHT，Vc对DPPH自由基有不同的清除能力。花叶滇苦菜黄酮提取物对DPPH自由基的清除能力非常强，这也证明，花叶滇苦菜中含有大量的黄酮类化合物，且浓度越高，抑制率越高，若进一步纯化，提高其纯度，其对DPPH自由基的清除能力有望超越Vc。

3 结论

（1）采用乙醇提取法，80%乙醇，80 ℃抽提，乙酸乙酯萃取，萃取前的黄酮类化合物得率为11.5%，萃取后黄酮类化合物提取率为4.8%。试验结果表示，萃取后的黄酮类化合物有所损失，但纯度更高。

（2）花叶滇苦菜中的黄酮提取液浓度为5.5 mg/mL时，对DPPH自由基抑制率达94.12%，随着花叶滇苦菜黄酮提取液的浓度越高，抗氧化活性也越强。

（3）花叶滇苦菜中的黄酮提取液、BHT和Vc在5.5 mg/mL时，对DPPH自由基的抑制率分别为94.12%、80.10%和 98.75%，相同浓度下花叶滇苦菜黄酮提取液对DPPH自由基的抑制率远远大于BHT，接近Vc。花叶滇苦菜黄酮有非常强的抗氧化作用，可为花叶滇苦菜资源的综合利用和天然抗氧化剂的开发提供参考和理论支撑。

4 展望

黄酮类化合物安全无毒，又因其具有较强的抗氧化活性及药理活性，近年来黄酮类化合物在医疗、食品、化妆品等领域逐渐得到广泛的应用。花叶滇苦菜中有大量黄酮类物质，经本次研究发现花叶滇苦菜黄酮有很好的抗氧化性能。后续可以通过大孔树脂、聚酰胺及葡聚糖凝胶柱层析等对花叶滇苦菜黄酮进一步纯化，研究纯化后黄酮的抗氧化活性。还可以将纯化后的黄酮添加到食品及护肤品中，进行应用研究，为花叶滇苦菜黄酮的开发利用提供进一步的理论依据。