桃红四物汤对心肌梗死后心室重构及血管紧张素受体1表达的影响

李杏　谭章斌　刘彬　张竞之　周迎春

摘要 目的：觀察桃红四物汤对心肌梗死后心室重构的作用以及对血管紧张素受体1（AT1）表达的影响。方法：通过结扎大鼠冠状动脉构建心肌梗死后心室重构模型。将大鼠随机分为假手术组、模型组、卡托普利组、桃红四物汤低、中、高浓度组，每组12只，每组大鼠连续给药12周。治疗结束后采用多普勒超声心动图评价大鼠心功能，计算心脏质量/体质量比率，采用苏木精-伊红和Masson染色观察心肌组织的形态变化和胶原沉积水平，并通过免疫组织化学法观察胶原蛋白I和胶原蛋白Ⅲ的表达，Western Blotting检测心肌组织中AT1的表达水平。结果：冠脉结扎后大鼠出现明显的心脏结构改变和功能障碍。与假手术组比较，模型组大鼠出现心肌组织损伤，间质纤维化，而左室舒张末期内径（LVEDD）、左室收缩末期内径（LVESD）显著升高（P<0.01），而射血分数（EF）、短轴收缩率（FS）显著降低（P<0.01），心脏质量指数显著升高（P<0.01），同时胶原水平升高（P<0.01），胶原蛋白Ⅰ/Ⅲ表达比值显著增加（P<0.01），心肌组织中AT1表达水平显著上调（P<0.01）。与模型组比较，桃红四物汤各浓度组与卡托普利组均可显著改善心肌组织的病理变化，提高EF和FS，降低LVEDD和LVESD，降低心脏质量指数，抑制心肌组织中过度胶原形成和胶原蛋白Ⅰ/Ⅲ表达比值，同时显著降低心肌组织中AT1表达水平（P<0.05或P<0.01）。结论：桃红四物汤可以显著降低心肌梗死后心肌纤维化，改善心室重构，其机制可能与其对AT1的抑制作用有关。

关键词 桃红四物汤;心肌梗死后心室重构;胶原;纤维化;血管紧张素受体1

Effect of Taohong Siwu Decoction on Ventricular Remodeling and Angiotensin Type I Receptor in Rats with Myocardial Infarction

LI Xing1， TAN Zhangbin2， LIU Bin2， ZHANG Jingzhi2， ZHOU Yingchun3

（1 The Third Affiliated Hospital，Southern Medical University，Guangzhou 510630，China; 2 The Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510260，China; 3 School of Traditional Chinese Medicine，Southern Medical University，Guangzhou 510515， China）

Abstract Objective：To observe the therapeutic effects of Taohong Siwu Decoction on ventricular remodeling and angiotensin type I receptor（AT1） in rats with myocardial infarction.Methods：Model of ventricular remodeling after myocardial infarction was established by ligating the anterior descending coronary artery in wistar rats.After the operation， the rats were randomly divided into a sham operation group， a model group， a Taohong Siwu Decoction low， medium， and high dose treatment group， and a captopril treatment group， with 12 rats in each group.Rats in each group were given continuous administration for 12 weeks.At the end of the treatment， doppler echocardiography was used to evaluate the heart function of the rats， the heart mass/body mass ratio was calculated， and the morphological changes and collagen deposition levels of myocardial tissue were observed by HE and Masson staining.Immunohistochemistry was used to observe the expression of collagen I and collagen Ⅲ.The expression level of AT1 in myocardial tissue were detected by Western Blotting.Results：After coronary artery ligation， rats showed obvious changes in cardiac structure and dysfunction.Compared with the sham operation group， rats in the model group had myocardial tissue damage and interstitial fibrosis.In addition， the left ventricular end systolic diameter（LVESD） and left ventricular end diastolic diameter（LVEDD） in model group were significantly increased（P<0.01）， while the ejection fraction（EF） and short-axis contraction rate（FS） was significantly reduced（P<0.01）.Heart mass index increased significantly（P<0.01）， while collagen content increased（P<0.01）.Collagen Ⅰ/Ⅲ expression ratio increased significantly（P<0.01）， and AT1 expression level in myocardial tissue was significantly increased（P<0.01）.Compared with the model group， each concentration group of Taohong Siwu Decoction and the captopril group can significantly improve the pathological changes of myocardial tissue， increase EF and FS， reduce LVEDD and LVESD， reduce heart weight index， and inhibit excessive collagen in myocardial tissue formation and collagen Ⅰ/Ⅲ expression ratio， while significantly reducing the expression level of AT1 in myocardial tissue（P<0.05 or P<0.01）.Conclusion：Taohong Siwu Decoction can significantly reduce myocardial fibrosis after myocardial infarction and improve ventricular remodeling.The mechanism may be related to the inhibitory effect on AT1.

Keywords Taohong Siwu Decoction; Ventricular remodeling after myocardial infarction; Collagen; Fibrosis; AT1

中图分类号：R256.2;R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.12.009

心血管疾病是目前导致世界人口死亡的重要原因，其中急性心肌梗死（Acute Myocardial Infarction，AMI）是导致心力衰竭和心源性死亡的主要原因。心肌梗死后缺血性心肌细胞坏死并收缩，释放炎症介质和纤维化因子，刺激心肌成纤维细胞增殖与胶原沉积替代坏死的心肌细胞，形成瘢痕心肌，影响心脏的收缩、舒张和电功能，从而导致左心室扩张，最终引起心脏功能障碍并促进心室重构（Ventricular Remodeling，VR）[1]。心肌梗死后心室重构是心力衰竭的重要病理基础，并且贯穿于整个过程，是远期发生心源性死亡的重要危险因素之一[2-3]。因此，延迟或预防心室重构是抵御心力衰竭的关键因素。

桃红四物汤是活血养血的代表方，记载于清代吴谦的《医宗金鉴》，由桃仁、红花加四物汤（熟地黄、当归、白芍、川芎）组成。现代药理学研究表明桃红四物汤具有止痛、抗炎、改善微循环、抗动脉粥样硬化及调节免疫的作用[4-5]，然而其對心肌梗死后心室重构的影响及作用机制仍未明确。本研究采用左冠状动脉前降支（LAD）结扎法制备大鼠心肌梗死模型，通过观察大鼠心功能、心脏质量/体质量比率、胶原沉积等指标，评估桃红四物汤改善心肌梗死后心室重构的作用，并探讨肾素-血管紧张素系统下游信号因子血管紧张素受体1（AT1）在桃红四物汤抗心肌梗死后心室重构过程中的作用，进一步探索桃红四物汤抗大鼠心肌梗死后心室重构发挥心脏保护作用的分子机制，为桃红四物汤抗心肌梗死后心室重构临床应用提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 从南方医科大学实验动物中心（动物许可证号：SCXK粤2006-0015）购买本研究所需雄性SPF级Wistar大鼠（体质量150～200 g）72只，在标准条件下（温度22～24 ℃;湿度（50±5）%;12 h光照）常规饲养。本研究经南方医科大学动物伦理委员会审查批准（伦理审批号：L2018017）。

1.1.2 药物 桃仁、红花、熟地黄、当归、川芎、白芍购买自南方医科大学南方医院中药房，经鉴定符合中华人民共和国药典标准。

1.1.3 试剂与仪器 Ⅰ、Ⅲ型胶原单克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司，批号：bsm-52478R，bs-0549R）;AT1、β-actin单克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司，批号：PB0492，BM0627）;免疫组织化学染色试剂盒（广州杰特伟生物科技有限公司，批号：KGSP01）;彩色多普勒超声诊断仪（飞利浦电子集团，荷兰，型号：iu22）;光学显微镜（Olympus公司，日本，型号：BX51）;高速低温离心机（Sigma公司，美国，型号：33K30）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 将72只大鼠随机分为假手术组、模型组、卡托普利观察组、桃红四物汤低浓度组、桃红四物汤中剂量组、桃红四物汤高浓度组，每组12只。假手术组进行除了冠状动脉前降支结扎以外模型制备的全部手术操作，其余大鼠均参照先前的研究构建心肌梗死模型[6]，水合氯醛（280 mg/kg）麻醉大鼠，将大鼠仰卧固定在手术台上，通过小型动物呼吸机进行气管插管，在胸骨上方约1 cm处向左稍微切一个切口，然后将肌肉层钝性分离。在第三和第四肋间间隙打开胸腔，以暴露心脏并结扎冠状动脉前降支，肉眼观察结扎区变白后进行缝合。术后检测心电图，以ST段抬高作为心肌梗死模型成功建立的标志。

1.2.2 干预方法 卡托普利观察组以25 mg/（kg·d）卡托普利灌胃，桃红四物汤低浓度组、中浓度组、高浓度组分别以2.43 g/（kg·d）、4.86 g/（kg·d）、9.72 g/（kg·d）中药水煎液灌胃，均连续给药12周。假手术组、模型组均正常饮水12周。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 多普勒超声心动图指标 通过多普勒超声心动图评估大鼠心脏收缩功能。术后12周，采用1.5%异氟烷麻醉大鼠，使用超声仪进行二维M型超声心动图，在乳头肌水平短轴观察心脏。采用12 MHz探头检测来自5个连续心动周期的左心室形态，记录左心室收缩末期直径（LVED）、左心室舒张末期内径（LVEDD）、左心室收缩末期内径（LVESD），根据LVED和LVEDD测量缩短分数（FS）和LV射血分数（EF）。操作者并不知晓动物分组及处理情况。

1.2.3.2 心脏质量/体质量比率 术后12周进行超声心动后，处死各组大鼠。在处死大鼠前测量体质量，通过尾静脉注入10%氯化钾注射液促使心脏停止搏动于舒张末期。打开胸腔充分暴露心脏，去除多余的筋膜后，迅速用镊子取出心脏，使用冰冻生理盐水清洗以去除淤血。随后测量心脏大小与重量，并计算心脏质量指数（心脏质量/体质量）。

1.2.3.3 大鼠心肌组织病理学观察 心脏组织经固定、包埋、切片后，采用苏木精-伊红（HE）染色法和Masson三色染色法对大鼠心肌组织进行组织病理学观察;同时采用医学病理图像系统计算心肌细胞横切面积。心肌组织中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原蛋白的表达水平则通过免疫组织化学进行测定。

1.2.3.4 大鼠非梗死区心肌AT1水平测定 采用Western Blotting法检测心肌梗死大鼠非梗死区心肌AT1水平，比较各组心肌梗死后大鼠非梗死区心肌AT1蛋白表达水平。

1.3 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件对研究数据进行统计分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，所有差异均为正态分布变量，并通过单向方差分析进行比较，方差齐时，2组比较采用最小显著性差异法（Least Significant Difference，LSD），当方差不齐时，采用Dunnett′s T3方法两两比较。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠体质量、心脏质量、心脏质量指数比较 各组间体质量比较，差异无统计学意义（P>0.05）。结扎术后4周，与假手术组比较，模型组心脏质量指数（HW/BW）明显升高，差异有统计学意义（P<0.01），提示模型组大鼠心肌梗死后出现心室肥厚;而桃红四物汤低、中、高剂量组与卡托普利治疗能够降低心脏质量、心脏质量指数;与模型组比较，差异有统计学意义（P<0.01），同时桃红四物汤各剂量组间心脏质量、心脏质量指数与卡托普利组比较，差异均无统计学意义（均P>0.05）。提示桃红四物汤与卡托普利治疗均能显著减轻心室肥厚且疗效相近。见图1A、E。

2.2 各组大鼠心肌组织HE染色结果 采用HE染色观察心肌组织病理改变情况，假手术组心肌排列整齐规律、细胞核完整、染色均匀，而模型组心肌纤维增粗、排列紊乱、细胞间隙增大、部分细胞核深染或破裂，并可见炎症细胞浸润在肌纤维附近;桃红四物汤低、中、高剂量组和卡托普利观察组与模型组比较，心肌纤维增粗不明显，细胞排列较规整、心肌细胞结构更完整、炎症浸润明显减轻，其中桃红四物汤高剂量组效果最明显。见图1B-C。

2.3 各组大鼠干预后心功能变化比较 结扎术后12周，超声心动图结果显示模型组大鼠与假手术组比较，冠脉结扎后LVEDD、LVESD显著升高（P<0.01），而LVEF、FS顯著降低（P<0.01）;接受卡托普利及桃红四物汤治疗的各组，LVEDD、LVESD均有不同程度的降低，LVEF、FS均有升高（均P<0.01），其中桃红四物汤各剂量组疗效与卡托普利组对心功能的改善指标比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见图1D、G-J。

2.4 各组大鼠心肌细胞横切面积测定 与假手术组比较，模型组和桃红四物汤低、中、高剂量观察组、卡托普利观察组心肌细胞横切面积显著增加，差异有统计学意义（P<0.01）;桃红四物汤各剂量观察组与卡托普利观察组心肌细胞横切面积较模型组降低（P<0.01）。见图1F-I。

2.5 各组大鼠心脏组织胶原沉积情况 采用Masson染色观察心肌组织胶原变化，蓝色区域为胶原纤维组织，红色为心肌细胞、纤维细胞和红细胞。与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织梗死区及非梗死区均可见大片蓝染区域，呈网状纤维结缔组织增生，提示模型组大鼠已发生心室重构，心脏组织出现明显纤维化。而桃红四物汤各剂量观察组及卡托普利观察组心肌组织中蓝染区域显著减少（P<0.05），提示桃红四物汤与卡托普利治疗均能有效减轻冠脉结扎引起的心肌纤维化。见图2A。

2.6 各组大鼠心肌组织中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原蛋白表达变化 为了量化桃红四物汤对心肌纤维化的影响，通过免疫组织化学法测量心肌非梗死区的Ⅰ型和Ⅲ型胶原表达水平。与假手术组比较，模型组Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的沉积显著增加，Ⅰ/Ⅲ型胶原蛋白的比值升高，提示Ⅰ型胶原合成较Ⅲ型胶原更为明显，而桃红四物汤各剂量组与卡托普利组均显著减少了Ⅰ型（P<0.05）和Ⅲ型胶原的水平（P<0.05），并降低了Ⅰ/Ⅲ型胶原蛋白的比值。见图2B-E。

2.7 各组大鼠非梗死区心肌AT1表达变化 采用Western Blotting检测非梗死区心肌AT1的表达，与假手术组比较，模型组大鼠非梗死区心肌组织AT1蛋白水平显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）;治疗4周后，桃红四物汤低、中、高剂量观察组与卡托普利观察组均能降低冠脉结扎后非梗死区心肌组织AT1蛋白表达水平（P<0.01）;其中，桃红四物汤高剂量观察组AT1蛋白下降最为明显，与卡托普利观察组间心肌组织AT1蛋白表达水平相似，差异无统计学意义（P=0.838）。见图3。

3 讨论

中医古籍并无心肌梗死后心室重构病名，后世医家根据其临床表现将之归纳为“胸痹”范畴。桃红四物汤作为补血活血代表方，常用于治疗心脑血管疾病和血液循环障碍。临床研究发现桃红四物汤能够显著改善心血瘀阻型稳定型冠心病患者临床症状，提高生命质量[7]。一项纳入959例心绞痛患者的荟萃分析表明，桃红四物汤与常规治疗相结合能够有效缓解心绞痛且无明显不良事件[8]。此外，一项网络药理学研究显示，桃红四物汤可能对包括心力衰竭、局部缺血-再灌注损伤、局部缺血性心脏病、心肌梗死和中风等疾病具有治疗作用[9]。实验研究发现桃红四物汤和低剂量组织型纤溶酶原激活剂的组合可减少梗死性中风后脑缺血区域的梗死体积，增加脑血流量并减少细胞凋亡[10]。本研究中的心肌梗死大鼠模型在冠脉结扎12周后表现出心功能减弱、心脏压力增加、心室体积扩大，以及心脏间质胶原过度沉积，表明心肌缺血对大鼠的心脏功能和心室结构产生了病理影响。而桃红四物汤治疗12周后，通过改善心肌梗死大鼠心肌收缩和舒张功能，减少心室体积和纤维化面积，从而减轻心肌梗死后心室重构，表明桃红四物汤能够有效改善心肌梗死后大鼠的心功能，发挥保护心脏作用。

心肌纤维化是纤维细胞异常增生和胶原蛋白过度累积所致[11]。心肌中的胶原稳态对于维持正常的心脏功能至关重要。然而，缺血性损伤后非梗死心肌的生物力学和生化变化引起的进行性反应性纤维化在心力衰竭的发展中起重要的作用[12]。研究表明多种补血活血类中药或中药复方能够通过减轻心肌纤维化改善心肌梗死后心室重构[13-14]。本研究采用Masson三色染色法对心肌胶原进行检测，发现模型组大鼠梗死区及非梗死区均可见大量胶原纤维沉积，桃红四物汤各剂量观察组大鼠心肌间质纤维化较模型组明显减少，能显著降低胶原水平（P<0.01）。胶原为心肌间质的主要成分，其中以Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原为主[15]。在压力超负荷相关的心力衰竭患者中发现心肌组织中Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的异常沉积，以及Ⅰ/Ⅲ胶原蛋白比例上调[16]。本实验进一步采用免疫组织化学法检测心肌组织中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原的蛋白表达，结果发现模型组左室非梗死区Ⅰ/Ⅲ胶原蛋白的比值明显增加，而经桃红四物汤治疗12周后胶原蛋白表达显著减少，并降低了Ⅰ/Ⅲ胶原蛋白的比值，提示桃红四物汤能有效抑制心肌梗死后的胶原沉积、减缓心肌纤维化。

肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）的异常激活是急性心肌梗死过程中心室重构发生、发展的主要原因[17]。血管紧张素Ⅱ通过血管紧张素受体1（AT1）刺激诱导产生超氧物和过氧化氢等细胞毒性产物，介导心间质成纤维细胞的增殖，促进胶原沉积，诱导心肌肥大[18]。大量实验研究表明抑制AT1能够减少心室肥大，恢复冠状动脉阻力并减少心肌纤维化，减缓心室重构[19-20]。本实验研究发现，桃红四物汤对心肌梗死后心室重构大鼠心功能和心室肥大的治疗作用与卡托普利相当。对大鼠非梗死区心肌组织AT1蛋白表达水平进一步观察，发现AT1蛋白在心肌梗死后显著升高，而桃红四物汤治疗能够剂量依赖性地抑制心肌组织AT1蛋白的表达，提示桃红四物汤可能是通过抑制心肌AT1蛋白的异常表达发挥抗心肌梗死后心室重构作用。

综上所述，桃红四物汤能够有效减缓心肌梗死后心室重构，该心脏保护作用主要通过改善心肌梗死后心功能、维持心肌细胞组织正常形态、抑制胶原沉积与心肌纤维化、抑制心肌肥厚实现。抑制大鼠非梗死区心肌AT1蛋白表达可能是桃红四物汤改善心肌梗死后心室重构的作用机制之一。

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（2020-08-24收稿 責任编辑：吴珊，徐颖）

基金项目：国家自然科学基金项目（81973645，81673805）;广东省科技计划项目（2015A020211040）;广东省基础与应用基础研究基金项目（2019B1515120026）

作者简介：李杏（1986.11—），女，博士，主治医师，研究方向：中西医结合防治心血管疾病，E-mail：252509450@qq.com

通信作者：周迎春（1963.12—），女，博士，主任医师，教授，研究方向：中西医结合防治心血管疾病，E-mail：zhychun@126.com