进口小麦中链格孢菌的快速鉴定方法研究

李毅然，薛佳欣，梁 靓，兰 茜，秦晋一，郭家琪，孙 浩

（1.西安海关技术中心，陕西 西安 710068；2.长安大学 建工学院，陕西 西安 710061；3.西北大学 城市与环境学院，陕西 西安 710127）

进境作物携带链格孢菌，会给国内农作物带来严重危害，对国家农业生产安全、农产品食用安全有严重威胁。在口岸检疫过程中经常发现进境小麦携带病原菌。其中，链格孢菌是进口粮食作物经常携带的病原菌之一。链格孢菌属于真菌的一种，为半知菌暗色丝孢菌，是农作物的主要致病菌之一[1]，能使小麦、玉米、土豆、苹果、柑橘、烟草等在内的几十种农作物发病[2]。除此之外，还会引起如日本梨黑斑病等众多病变，造成农产品霉变，导致瓜果、蔬菜和储存食品腐败及变质[3]。链格孢菌的代谢会产生毒素，加重作物病害及食品腐败现象[4]，且毒素会不断地在农作物、瓜果、蔬菜和日常食物中富集，对食品安全造成严重威胁[5]。链格孢菌的孢子还可以通过释放过敏原，引发诸如哮喘[6-7]等人体疾病，从而对人体健康产生严重威胁。因此，加强有关链格孢菌的研究，制定链格孢菌的防控策略尤为重要。

通常，病原微生物的鉴定方法分为传统方法（菌落、细胞形态和生理生化、细胞组分鉴定）和分子检测方法（蛋白质检测、基因检测）[8]。传统的病原微生物分离鉴定方法需运用各学科手段综合观察，涉及步骤繁杂，速度缓慢，但准确性高。而以聚合酶链式反应为基础的分子生物学检测方法检测DNA序列灵敏度高[9]，但容易出现假阳性和假阴性的结果，无法做到眼见为实的确诊。对此，可以利用微生物细胞膜的磷脂脂肪酸(Phospholipid fatty acid，PLFA)分析[10]来解决这一问题，磷脂脂肪酸含量在自然生理条件下相对稳定，具有遗传稳定性，可作为微生物分类的重要标记[11]。PLFA分析兼顾快速性和准确性，有望成为传统方法和分子检测方法的有力补充[12]。对于微生物的细胞膜磷脂来说，PLFA是其重要成分。不同类群微生物通过不同的生化途径，细胞膜会形成不同的磷脂脂肪酸，这种现象造成在同一类群的微生物中，某些PLFA生物标记出现频率较高。PLFA具有较高的结构多样性和生物学特异性，可作为区分活体微生物群落的生物标记，其也是微生物分类的主要依据[13]。PLFA分析方法早有研究，之前对25种芽孢杆菌进行脂肪酸系统发育分析，发现其能充分体现菌株间的亲缘关系，可以按生物学特性进行聚类分群[14]。利用PLFA生物标记对细菌分类鉴定，其分析结果与传统检测方法相一致[15]。甚至对感染鱼类病原体的希瓦氏菌，也使用PLFA分析方法确定出了25种特征脂肪酸[16]。基于PLFA分析方法，确定了从鸭圈中分离得到的病原菌Pseudochrobactrum glaciei为一个新物种[17]。使用PLFA分析方法，可以区分鼠疫耶尔森氏菌（Yersinia pestis）和假结核耶尔森氏菌（Yersinia pseudotuberculosis），而其他的鉴定技术很难将其区分开[18]。由此可见，不同微生物具有不同的PLFA组成和含量，可用来标记特定微生物类群和生物量[19]，但有关植物病原链格孢菌磷脂脂肪酸的研究尚未见详细报道。

进境小麦通关时间有限，在短时间内对大批量小麦进行筛查需要消耗大量的人力和物力。通常检验是通过传统方法完成的，但对可疑病变作物，最好就地提取生物DNA，防止二次污染，但其步骤烦琐，仪器要求较高，对海关现场检验工作环境洁净度要求苛刻。此外，对于一线检验站而言，是没有能力进行DNA测序的，需要送到相关公司进行商品化测序，耗时较长，不利于进口小麦通关过程中检验检疫的快速高效完成。根据海关检验检疫的实际操作需求，急需寻找一种兼顾快速性、准确性，能大批量检测小麦真菌病的筛查手段。鉴于此，本研究以哈萨克斯坦进境小麦为对象，采用ITS序列扩增和NCBI数据库比对，确定携带的病原菌株。同时，从小麦病变部位上收集微生物样品，测定其PLFA种类和含量；比较不同生物取样量的PLFA分布图谱，确定检出该菌株的生物取样量范围；运用数理统计明确该菌株的PLFA指纹图谱、特征脂肪酸的种类和相对丰度；建立多元线性回归模型，量化生物取样量与特征脂肪酸之间的相关关系，尝试通过特征脂肪酸响应值推算出小麦携带的病原微生物量，以便为建立简便有效的快速鉴定方法提供思路，为评估进口小麦携带的病菌危害、评价粮食品质提供第一手科学数据，为建立相关品质标准提供理论数据。

1 材料和方法

1.1 试剂

LB肉汤培养基，北京奥博星生物技术有限责任公司生产；马铃薯葡萄糖琼脂（含氯霉素），北京路桥技术有限责任公司生产；Taq聚合酶、dNTPs、DNase Free Water，Takara公司生产；10×Buffer（含MgCl2），购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；K2HPO4、KH2PO4、饱和NaCl、甲醇、浓盐酸、NaOH颗粒、正己烷和甲基叔丁醚，均购自上海国药集团有限公司。

1.2 菌株培养

对哈萨克斯坦进口小麦进行抽检，每抽检批次送样品1 kg，在西安海关技术中心进行筛选检验。采集小麦病变部位微生物样本，接种于PDA培养基中培养2～4 d，至长出菌落。挑单菌落、划线、25℃培养。重复3次，分离纯化得到单菌株。观察单菌落的形态特点，采用基因组提取试剂盒（天根生化科技有限公司）提取DNA，置于-20℃冷冻保藏，备用。

1.3 菌株镜检

取50 g感病小麦放入200 mL三角瓶，加入100 mL纯水和40μL吐温20，Parafilm膜封口，200 r/min振荡5 min。纱布过滤，滤液导入50 mL离心管，1 000 r/min离心5 min，弃去上清液。沉淀物中加适量席尔氏液混匀，取20μL滴到载玻片上，在显微镜20倍和40倍下进行观察。

1.4 菌株DNA鉴定

将病原菌微生物划线培养3次，采用通用引物ITS1和ITS4，对提取的病原菌DNA样本进行PCR扩增。扩增体系50μL：DNA模板4μL、dNTPs(10 mmol/L)1μL、ITS1(10μmol/L)2μL、ITS4(10μmol/L)2μL、10×Buffer(含25 mmol/LMgCl2)8μL、Taq聚合酶（5 U/μL）1μL、ddH2O 32μL。PCR反应程序：94℃预变性3 min；94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸50 s，33个循环；72℃延伸10 min。

PCR扩增产物用通用型DNA回收试剂盒（天根生化科技有限公司）纯化，纯化产物送深圳华大基因股份有限公司进行序列测定，在NCBI数据库进行核酸比对，获取同源比对序列最相似物种。

1.5 菌株细胞膜磷脂脂肪酸鉴定

在小麦病变区采集生物样本，取样量介于0.070～0.190 g，放入10 mL的10 mmol PBS缓冲液涡旋混匀，1 000 r/min离心5 min，弃去上清液，漂洗3遍，称量沉淀物确定生物取样量。沉淀物置于8 mL试管中，用1 mL皂化试剂（300 g/L NaOH溶液∶甲醇=1∶1）提取，并置于100℃沸水水浴30 min。用自来水冷却试管，加入2 mL甲基化试剂（H2O∶甲醇∶HCl=22∶46∶32）。混合涡旋混匀，80℃水浴10 min，待溶液冷却至室温后，加1 mL预混溶剂（正己烷∶甲基叔丁基醚=1∶1）萃取。将其置于旋转器中，轻轻倒转10 min，取出并丢弃水相。使用3 mL的5%NaOH溶液作为碱洗样品，对上层有机相进行GC-MS分析[20]。

1.6 数据处理

通过Canoco 5软件对生物取样量与链格孢菌细胞膜PLFA响应值进行冗余分析。利用SPSS25.0软件对生物取样量与PLFA种类进行相关性分析，并在α=0.01和0.05水平上检查其显著性。根据Matlab R2014a软件的多元线性回归方法，建立依靠PLFA特征峰响应值追溯链格孢菌生物携带量的数学量化模型。

2 结果与分析

2.1 致病菌株的形态特征和DNA鉴定

通过相差显微镜观察（图1），在PDA培养基上菌落呈絮状，内部为淡绿色，边缘为灰白色，培养基背面为黑褐色。分生孢子梗单生，直立或膝状弯曲，有分隔。分生孢子链生，卵形或倒梨形，表面具横隔和纵隔，成壁砖状结构，横隔较粗。根据菌物培养性状、分生孢子的成链特征和形态等，尤其是典型的分生孢子特性[21]，可初步确定所分离的真菌为半知菌类链格孢属链格孢菌（Alternaria alternata）。根据NCBI数据库比对结果，同源性超过99.99%，确定病原菌为链格孢属链格孢菌。

图1 链格孢菌的菌落、孢子和孢子丝形态特征Fig.1 Appearance characteristics of the colonies，spores and spore filaments of Alternaria alternata

2.2 致病菌株的PLFA分布特征

通常，磷脂脂肪酸的命名采用分子通式X:Y wZ(c/t)iso/anteiso。其中，X表示主链上的碳原子个数，Y表示双键的个数，w表示双键，Z则代表双键的位置，即双键距离分子末端碳原子的个数，c（cis）、t（trans）则表示分子的顺、反式结构，iso和anteiso表示甲基分别在距离分子末端第2、3个碳原子上的位置。

在该菌株的细胞膜中共测出15种磷脂脂肪酸，其中，前4种脂肪酸含量约占总量的80%（图2）。含量最高的是18:2 w6,9c，占比超过38%。由于18:2 w6c和18:3 w6c是典型的真菌特征脂肪酸[22]，因此，由该类脂肪酸含量较高推断该菌株属于真菌。18:1 w9c表征常见的有致病特征的真菌脂肪酸[23]，其占比也达到了16.95%。直链饱和脂肪酸16:0、18:0、14:0占比分别达到15.21%、4.56%、2.06%，相较于其在细菌细胞膜中的含量和差异性，饱和脂肪酸在现有报道中，常用于表征细菌菌株[23]。15:0 iso占比8.58%，是最有潜力的特征脂肪酸。剩余脂肪酸的占比都不高于5%，如直链饱和脂肪酸17:0 iso、15:0 anteiso、16:0 iso，以及不饱和脂肪酸16:1 w7c，其占比分别为2.36%、1.52%、1.38%、2.30%。本研究计划从上述磷脂脂肪酸中筛选出适合的特征脂肪酸，构建Alternaria alternata的PLFA指纹图谱。

图2 致病菌株的PLFA分布Fig.2 PLFA distribution of pathogenic strains

2.3 小麦病变区检测出PLFA的生物取样量

在排除仪器误差的前提下，人为误差需要避免。现场检验检疫中，由于不同检验员在取样量上有差异，人为造成测得的磷脂脂肪酸（PLFA）响应值高低不一，显著特征峰的出现不稳定，阻碍了PLFA技术的广泛应用。为此，需要量化链格孢菌检验的生物取样范围。根据上述归纳出的潜在指纹区范围，研究不同生物取样量对检测出链格孢菌磷脂脂肪酸种类和分布的影响，结果如图3所示。

图3 不同生物取样范围对磷脂脂肪酸种类和分布的影响Fig.3 Effects of different sampling ranges on the species and distributions of phospholipid fatty acids

当生物取样量介于0.070～0.190 g时，15:0 iso、15:0 anteiso、16:1 w7c和18:2 w6，9c磷脂脂肪酸之和的平均占比超过50%，按从大到小排序依次为18:2 w6,9c＞15:0 iso＞15:0 anteiso＞16:1 w7c。当生物取样量介于0.070～0.090 g时，18:2 w6，9c的平均占比达到47.02%左右，15∶0 iso的平均占比稳定在2.87%，15:0 anteiso和16∶1 w7c的平均占比在0.83%；而当生物取样量为0.190 g时，18:2 w6，9c的占比最大，为36.81%，15:0 iso的占比其次，为10.55%，15:0 anteiso和16:1 w7c的占比很少。由此可见，在0.190 g生物取样量中脂肪酸的种类和分布与其他生物取样量中的结果有明显差异。t检验结果表明，当生物取样量为0.190 g时，在α=0.01下，其磷脂脂肪酸的分布和种类有极显著差异。当生物取样量介于0.070～0.090 g时，其各种磷脂脂肪酸的种类和分布无显著性差异。因此，小麦上病变部位的生物取样范围应确定为0.070～0.090 g。

2.4 致病菌株的特征脂肪酸种类确定

利用不同的生物取样量与10种脂肪酸的占比变化进行相关性分析，结果见表1。15:0 iso、15:0 anteiso、16:1 w7c和18:2 w6，9c这4种脂肪酸与生物取样量的相关系数高达1.00。同时，P值明显小于显著性水平0.05，说明15:0 iso、15:0 anteiso、16:1 w7c和18:2 w6，9c这4种脂肪酸与生物取样量呈显著线性相关。选取15:0 iso、15:0 anteiso、16:1 w7c、18:2 w6，9c 4种磷脂脂肪酸的PLFA响应值和生物取样量进行冗余分析，如图4所示。

表1 不同生物取样量与PLFA种类之间的相关性分析Tab.1 Correlation analysisbetween different biological samples and PLFA species

图4 生物取样量与链格孢菌细胞膜PLFA响应值之间的冗余分析Fig.4 Redundancy analysis between biological samples and PLFA response of Alternaria alternata

冗余分析图中，2个矢量的夹角大小可以反映两变量之间的相关程度，夹角越小说明相关程度越大，反之，则证明相关程度越小。从图4可知，15:0 iso、15:0 anteiso、16:1 w7c和18:2 w6，9c这几种磷脂脂肪酸响应值与生物取样量之间的夹角都小于45°，均具有较强的相关性。脂肪酸与取样量之间夹角大小的顺序为：16:1 w7c＞18:2 w6，9c＞15:0 anteiso＞15:0 iso。这与相关性分析得出的结论相一致。由此可以判定，链格孢菌的特征脂肪酸为15:0 iso、15:0 anteiso、16:1 w7c和18:2 w6，9c。

2.5 利用PLFA特征峰响应值追溯链格孢菌生物携带量的模型建立

采用溯源的方法，根据已知链格孢菌的特征脂肪酸种类以及相对应的PLFA响应值，推算小麦上携带的链格孢菌生物量，建立理论模型。该模型是基于0.070～0.090 g链格孢菌取样量进行的推算。

在相同的链格孢菌生物量下，不同磷脂脂肪酸种类的响应值整体上从大到小依次为18:2 w6,，9c＞15:0 iso＞15:0 anteiso，16:1 w7c＞15:0 iso的响应值相较其他脂肪酸明显。磷脂脂肪酸响应值与生物量的相关性，由强到弱依次为15:0 iso＞15:0 anteiso＞18:2 w6，9c＞16:1 w7c，15:0 iso与链格孢菌的生物量相关性最大，综上，可以尝试单独作为链格孢菌的判定标准。通过建立Matlab线性回归模型，发现15:0 iso单独与链格孢菌生物量呈良好的线性关系，15:0 anteiso、16:1 w7c和18:2 w6，9c的综合响应值与链格孢菌生物量同样呈现明显的相关，可以建立特征脂肪酸响应值与链格孢菌的生物携带量之间的量化关系双重模型。

对15:0 anteiso、18:2 w6，9c、16:1 w7c的响应值与生物携带量之间进行多元线性回归分析，得到理论模型（1）∶

公式（1）中，Y1为15∶0 anteiso、18:2 w6，9c、16:1 w7c回归计算出的生物携带量，C15:0anteiso、C16:1w7c、C18:2w6,9c分别为15:0 anteiso、16:1 w7c和18:2 w6c，9c的响应值。此外，分析15:0 iso的响应值与生物携带量之间的线性回归，整理出模型（2）∶

公式（2）中，Y2为15:0 iso回归计算出的生物携带量，C15:0iso为15:0 iso的响应值。

图5为利用病变小麦PLFA的响应值，构建的小麦携带链格孢菌量的预测模型。通过Matlab线性回归模型建立，发现15:0 iso单独与生物携带量呈良好相关关系，15:0 anteiso、16:1 w7c和18:2 w6，9c的综合值与生物携带量也呈现明显相关，因此，特征脂肪酸响应值与生物携带量之间的回归关系需建立双重模型。由图5知，当链格孢菌生物量为0.075 g时，双重模型会出现很大的误差，多元线性回归模型和单元线性回归模型相比，单元线性回归模型的误差较大。随着生物携带量增大，单元线性回归模型的变化也较明显。但是，由单元线性回归模型推算生物携带量只需知道15∶0 iso的响应值，由多元线性回归模型推算生物携带量需知道15:0 anteiso、18:2 w6，9c、16:1 w7c的响应值，相比之下，通过单元线性回归模型推算生物携带量较为简便。应该注意的是，在应用模型时应同时考虑Y1和Y2，只有当计算出的Y1与Y2的差值在0.001 8 g以内，该模型才有实际应用的科学稳定性。

图5 基于PLFA响应值预测链格孢菌携带量的双重线性回归模型Fig.5 Double linear regression model based on PLFA response value to predict the carried amount of Alternaria alternata

3 结论与讨论

随着人民生活水平的提高，我国对中亚地区小麦等粮食的进口量日益增大，其中可能携带检疫性致病菌。本研究经过形态学和分子学鉴定，确定从通过中欧班列运输进口的哈萨克斯坦小麦上分离得到的是半知菌类链格孢属链格孢菌（Alternaria alternata）。链格孢菌是农作物的主要致病菌之一，对农作物的危害巨大，如传入我国，将对我国的经济作物造成不可预估的损失，严重影响我国农产品的正常生产。链格孢菌适应性强，相对较低或较高的温度只能减缓而不会抑制其生长繁殖，昼夜变温更有利于孢子形成，其生长繁殖快，对营养要求低，产孢能力强，在一些廉价农产品上均可大量产生孢子，连续黑暗、空气充足条件下有利于产孢[24]。因此，在中欧班列的长途运输中，很容易产生大量孢子，影响小麦品质。链格孢菌细胞壁降解酶和毒素在侵染作物过程中大量累积，给农产品食用安全带来隐患。DNA分子鉴定可将微生物鉴别到种，但提取步骤烦琐，对仪器要求较高，工作环境洁净度要求苛刻，商品化测序耗时较长，不是鉴定进口小麦的便捷方式。

对比之下，采用磷脂脂肪酸分析法对进口小麦中链格孢属真菌进行鉴定，简单实用。首先，需要对生物取样量确定其范围，大于某一阈值后，各种磷脂脂肪酸响应值所占百分比会发生显著性变化。研究确定链格孢菌的生物取样量应介于0.070～0.090 g。采用GC-MS对菌株的磷脂脂肪酸进行分析，结果稳定。经冗余分析和相关性分析，小麦中链格孢属真菌细胞膜的特征脂肪酸为15:0 iso、15:0 anteiso、16:1 w7c和18:2 w6，9c。

利用特征脂肪酸与链格孢菌生物量之间的相关关系，建立双重回归理论模型：

Y1为15:0 anteiso、18:2 w6，9c、16:1 w7c回归计算出的生物量；Y2为15:0 iso回归计算出的生物量。基于对链格孢菌的特征脂肪酸种类、不同生物取样量以及相对应的PLFA响应值的分析，由模型可以推算小麦携带的链格孢菌生物量，量化小麦携带的致病菌量。为防止进口小麦携带检验检疫性真菌病害，减小潜在危害，提供一种既快速又简便的检验鉴定方法。

在实际操作中，从进口小麦上分离、获取一定量的生物磷脂脂肪酸，测得PLFA响应值，推算出小麦可能携带的病菌量。这样省去病菌纯化、DNA提取并测序的烦琐过程，使检验检疫过程趋于简化，结果更加稳定。特征脂肪酸的确立，能帮助检疫工作鉴定小麦携带病菌的微生物属群，但要想建立出入境检验检疫病菌特征脂肪酸文库，还需要进一步的深入研究。此外，这种方法可以帮助初步判定进口小麦携带的病菌量，该检疫技术不仅能定性，还可定量，为今后的检疫管理提供了宝贵的科学依据。