丁酸在亚急性瘤胃酸中毒和动物健康方面作用机制的研究进展

朱 智 纪邑奇 黄文明 左福元

(西南大学动物科学技术学院，西南大学医学研究院免疫学研究中心，重庆市肉牛工程技术研究中心，重庆 402460)

近年来，在集约化养殖中，为了提高生产效率而大量饲喂以谷物淀粉为主要能量饲料的高精料饲粮，其大量使用也提高了代谢性疾病的发病率。亚急性瘤胃酸中毒(subacute ruminal acidosis，SARA)是反刍动物生产中一种最常见的消化紊乱疾病，是由于饲喂过量的高度可发酵碳水化合物和不足的膳食粗纤维引起的[1]。SARA的后果包括采食量、纤维消化率和乳脂率降低，腹泻、蹄叶炎、肝脏脓肿和细菌内毒素增加，炎症方面表现为急性期蛋白增加[2]。由于我国优质粗饲料的资源缺乏，而且质量普遍较差，生产者为了追求较高的生产性能，生产中不得不大量使用富含淀粉的谷物精料来满足动物的营养需要，致使动物对优质纤维的摄入不足，高产奶牛和强度育肥牛羊发生酸中毒的情况普遍存在。SARA的发生已经成为制约我国牛羊生产的重要因素之一。

丁酸(butyrate)又称酪酸，具有腐臭的酸味。丁酸是瘤胃或大肠中主要的挥发性脂肪酸(volatile fatty acids，VFA)之一，占总VFA的10%～20%[3]。饲喂高谷物饲粮或增加丁酸比例时，瘤胃液pH降低，总VFA和丁酸浓度或比例增加[4-7]。相对于酸中毒易感牛，耐酸中毒牛的瘤胃液pH和丁酸浓度增加，总VFA浓度降低，而采食量没有显著变化[8]。活体试验表明，丁酸或丁酸盐能够促进瘤胃上皮细胞的发育，增加乳头的表面积[9-12]，增强VFA摄取和代谢相关基因和蛋白的表达[11-15]，以及改善高精料饲粮对上皮屏障功能的损害和诱导的炎症[16-17]。细胞培养研究表明，丁酸作为一种信号分子上调参与短链脂肪酸(short chain fatty acids，SCFA)及代谢物转运的基因表达[18-19]。丁酸可以通过激活G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor，GPR)[20-23]，或与β-羟丁酸作为组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)抑制剂[21-22,24-26]，在生物进程中发挥着广泛作用，如引起细胞凋亡和增殖、改变基因表达和调节机体免疫。本文综述了丁酸或其盐类对反刍动物的影响，探讨丁酸在SARA发生中可能存在的保护作用机制。

1 SARA的定义和发病机制

1.1 定义

由于SARA临床症状表现不明显，研究者多数采用瘤胃液pH或乳酸浓度的变化进行界定。SARA是瘤胃环境pH处于5.0～5.5、总VFA浓度升高、VFA比例向丙酸和丁酸转移、瘤胃液中累积乳酸浓度不超过5～10 mmol/L时的状态[27]。反刍动物发生SARA时瘤胃液pH的阈值设定不一。瘤胃液pH 5.5可以作为衡量SARA发生的阈值[2]，也有学者将瘤胃液pH阈值定为5.8[28]。Duffield等[29]建议，通过瘤胃穿刺、腹囊处瘤胃瘘管、胃插管获得的瘤胃液测定的用于预测SARA的pH阈值分别为5.5、5.8、5.9。多数研究采用连续动态监测瘤胃液pH的变化以及pH低于某个阈值所持续的时间长短综合判断SARA的发生。瘤胃液pH低于5.6并且每天持续时间不低于3 h可以界定为发生SARA[1,13]，也有学者以瘤胃液pH低于5.8且持续时间不少于3 h/d为标准[5]。瘤胃液pH处于波动之中，采样时间会影响pH。因此，通过阈值对SARA界定，在增加持续时间的基础上，需要反映取样时间以更加准确地定义SARA。

1.2 发病机制

1.2.1 有机酸中毒

高谷物饲粮(易发酵碳水化合物)在瘤胃中被微生物剧烈发酵，产生大量有机酸。研究发现，发生SARA的瘤胃内乳酸积累较少甚至没有[4,28,30]，而VFA浓度较高，在100 mmol/L以上[31]。瘤胃液pH是由瘤胃液中的质子浓度决定的，它依赖于饲粮发酵提供质子与质子消除之间的平衡状态。据估计，大约37%的质子在瘤胃中被唾液缓冲液中和，7%的质子向后段肠道转移而消失，剩下超过50%的质子被瘤胃上皮细胞吸收或上皮细胞分泌的缓冲液中和而清除[32]。瘤胃内过量VFA超过缓冲能力和上皮吸收能力，会导致VFA的大量累积，进而降低pH。多数学者认为，SARA是由VFA在瘤胃内过量蓄积所导致的[4,28,30]。

1.2.2 内毒素与生物胺中毒

脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)作为内毒素主要的抗原性和致病性部分，与革兰氏阴性菌表面结合十分紧密，当细菌快速生长或死亡裂解时会被释放出来。发生SARA后瘤胃菌群最明显的变化是革兰氏阴性菌拟杆菌门数量下降，推测瘤胃内LPS主要源于死亡的拟杆菌，但是拟杆菌LPS毒性低于大肠杆菌或其他肠杆菌科细菌[33]。饲喂高谷物饲粮时，瘤胃[16,34-36]、门静脉和肝静脉[31,35-37]以及回肠和盲肠[38-40]中LPS浓度显著升高。SARA发生期间低pH的生理环境会造成瘤胃上皮损伤，并对上皮细胞的选择性通透造成严重影响，使得大量内毒素透过瘤胃上皮进入血液，形成内毒素血症[2]。SARA发生时低pH环境使瘤胃黏膜发炎、损伤、网状内皮系统受损，使得解毒机能大大降低；长期的酸性环境引起革兰氏阴性菌大量死亡，释放的大量内毒素容易通过受损的瘤胃上皮移位进入血液，触发系统性炎症反应。

生物胺是一类低分子质量、碱性含氮化合物，在瘤胃中是由氨基酸前体经微生物酶发生脱羧反应，或者由醛类、酮类化合物经胺化而生成，如组胺、酪胺、腐胺、甲胺和色胺等。正常瘤胃液中组胺浓度很低，瘤胃上皮存在对组胺的分解和分泌过程，完整的上皮组织对组胺的通透性很低，有效限制了机体对组胺的吸收[41]。饲喂高精料可改变氨基酸代谢模式，致使瘤胃内组胺、酪胺、腐胺、甲胺等生物胺含量显著升高[5,42-43]。组胺不直接影响瘤胃上皮的通透性，而是通过受损的上皮吸收入血，避免了在上皮组织中的分解代谢，而屏障受损主要是由低pH环境造成的[44]。在高精料饲喂反刍动物的瘤胃中也发现乙醇和乙醇胺浓度显著升高[42-43]。高浓度乙醇会损害肠道黏膜屏障，进而增加细菌毒素的转运[45]。乙醇胺可作为细菌的碳源或氮源，包括致病菌沙门氏菌、埃希氏菌属等，促进致病菌的定植和致病作用[46]。长期低pH环境引起瘤胃微生物区系发生改变，产生大量内毒素、生物胺等有害物质，同时损伤上皮的黏膜屏障，进而增加有害物质吸收入血，进一步加重SARA的发展。因此，有机酸、内毒素和生物胺相互联系、共同作用引起SARA的发生发展。

2 丁酸对瘤胃的影响

2.1 对瘤胃发酵的影响

瘤胃是反刍动物主要的消化吸收和代谢场所。饲粮被微生物发酵产生VFA，主要成分乙酸、丙酸、丁酸的比例为75∶15∶10～40∶40∶20，主要受饲粮组成和饲喂时间的影响[3]。丁酸钠可以影响瘤胃VFA浓度和组成。高精料饲粮中添加丁酸钠增加了瘤胃液总VFA、丁酸和丙酸的浓度[16]。新生羔羊口服丁酸钠增加了瘤胃液总VFA、丁酸浓度和摩尔比例[12]。灌注不同剂量的丁酸钠，发现奶牛瘤胃总VFA和丁酸浓度线性增加，丙酸浓度二次曲线增加，而乙酸浓度不受影响[47]。研究瘤胃发酵进程时发现，灌注丁酸钠1.0 h后丁酸浓度显著增加，乙酸和丙酸浓度显著降低，2.5 h后乙酸和丙酸浓度恢复到灌注前水平，而丁酸浓度在2.5 h之前仍显著升高，3.5 h时才恢复到灌注前水平，总VFA浓度在不同时间点均没有显著变化[11]。瘤胃中乙酸和丙酸浓度的减少可能是由于丁酸对微生物的抑制作用[48]，或者是丁酸促进了瘤胃上皮对乙酸和丙酸的吸收[10]。

丁酸盐对瘤胃液pH影响小，或者可以改善pH环境。羔羊口服丁酸钠对瘤胃液pH没有显著影响[12]。在诱导奶牛出现SARA的饲粮中添加丁酸盐，导致瘤胃液最低pH升高，但平均pH、最高pH和pH低于5.6的持续时间不受影响[49]。也有研究表明，高精料饲粮中添加丁酸钠具有改善瘤胃液pH的作用[16-17,36]。Zhang等[17]认为，丁酸钠水溶液的碱性特点可能是诱导pH升高的原因。瘤胃液pH是通过酸的产生与清除之间的平衡来维持[32]。因此，高比例易发酵碳水化合物或者大量添加外源丁酸导致瘤胃中高浓度的丁酸可能会降低瘤胃液pH，并对瘤胃发酵不利。

2.2 对微生物区系的调控作用

丁酸对瘤胃微生物区系产生深远影响。Li等[48]向奶牛瘤胃中连续灌注丁酸(168 h，12.5 mol/d)，72 h时即引起瘤胃4个门类细菌、19个属类细菌、43个操作分类单元的数量发生显著变化，如拟杆菌门数量显著降低和硬壁菌门数量显著增加。Shen等[50]连续灌注丁酸钠(28 d，0.3 g/kg体重)显著降低了山羊瘤胃中硬壁菌门与拟杆菌门数量。微生物区系的不同反应可能与丁酸的灌注剂量和灌注时间有关。硬壁菌门和拟杆菌门分别是主要的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，在瘤胃微生物群落中占80%～90%[43,48,50-51]。添加丁酸盐显著降低瘤胃液LPS浓度[16,36]，或者趋于降低LPS浓度[49]，这可能与丁酸对微生物区系的影响有关，如作为革兰氏阴性菌的拟杆菌门。丁酸被认为是平衡细菌生长的信号分子[52]。丁酸浓度的升高似乎对丁酸产生菌具有刺激作用[48]。丁酸钠导致细菌区系由丁酸产生菌向乙酸产生菌和丙酸产生菌转变，这种变化可能是微生物群用来维持瘤胃中主要VFA稳定比例的一种策略[50]。Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)在塑造消化道微生物的组成中起着重要作用，丁酸可能通过影响上皮中TLR信号变化(如TLR2和TLR5基因表达)来影响微生物组成[50]。饲喂高谷物饲粮或出现SARA时，瘤胃出现了大量丁酸产生菌[43,51]。瘤胃内容物中总菌16S rRNA基因拷贝数与丁酸比例在耐酸中毒牛和酸中毒易感牛中分别存在正相关(r=0.74)和负相关关系(r=-0.73)，丁酸产生菌的数量和活力在耐酸中毒牛中高于酸中毒易感牛[53]。因此，关于微生物菌群尤其是丁酸产生菌数量和功能的研究有助于阐明微生物在SARA发生中的作用和机制。

2.3 对瘤胃上皮的影响

2.3.1 对上皮功能的影响

瘤胃发酵产生的大量VFA通过瘤胃上皮吸收，为机体提供70%以上的能量需要，而瘤胃乳头能够促进其吸收。如果瘤胃乳头上皮细胞增殖严重不足，会导致角化不全，相应地引起VFA吸收降低以及上皮易于损坏和感染。灌注乙酸、丙酸和丁酸可以刺激上皮的生长与发育，其中丁酸的作用最显著，其次是丙酸[54-55]。丁酸被认为是瘤胃上皮发育的主要刺激物，可能与瘤胃壁代谢丁酸供能直接相关，因为丁酸是上皮中吸收最广泛且很大程度上被代谢的VFA，其能值也高于丙酸和乙酸[56]。多项研究表明，丁酸或丁酸盐能够促进瘤胃上皮增殖，增加乳头大小和表面积，进而增强VFA吸收[9-12]。丁酸是瘤胃细胞凋亡的特异性抑制剂，通过减少细胞凋亡来刺激黏膜发育[54]。丁酸增强瘤胃上皮细胞的增殖，同时垂死或死亡细胞的比例也增加[9]。Soomro等[11]发现，丁酸钠似乎仅刺激快速增殖过程中产生的不需要或有缺陷的细胞的凋亡，引起增殖速率高于凋亡速率，共同调控上皮细胞的增殖和凋亡。丁酸对前胃的分化和成熟至关重要，但是过量的丁酸可能是有毒的，尤其是在体内低pH的情况下[52]。高淀粉饲粮中VFA的过度产生以及丁酸浓度的大量增加会破坏瘤胃上皮紧密连接，改变瘤胃选择性通透，高渗透压和低瘤胃pH导致上皮的屏障功能受损，进而降低VFA的吸收[34,57]。因此，适当提高瘤胃丁酸水平，促进瘤胃上皮细胞增殖，增加乳头表面积和VFA吸收，进而可以在一定程度上增强SARA的耐受程度。

丁酸产品也常用于促进瘤胃发育，改善瘤胃上皮的吸收和屏障功能。向饲喂不同营养水平的阉公牛瘤胃中灌注丁酸，瘤胃乳头的长度、宽度和表面积均增加了20%～40%[9]。高精料对上皮角质层破坏严重，而添加丁酸钠的瘤胃上皮保持完整，尽管上皮中也有一些炎症细胞募集，但其数量比高精料组少得多，表明丁酸钠可以减轻高精料引起的瘤胃上皮的局部炎症和破坏，并保护上皮完整性[16]。类似研究显示，丁酸钠可以改善高精料饲粮对山羊瘤胃上皮屏障功能的损害[17]。代乳粉中添加丁酸钠有助于新生犊牛增重、健康和代谢产物的生成，并间接刺激瘤胃发育，而开食料中添加甘油三酯包被丁酸钠直接刺激了瘤胃发育[58]。口服丁酸钠的新生羔羊表现出更高的排空瘤胃重量，更大的瘤胃乳头长度、宽度和表面积，以及更大的角质层和总上皮厚度[12]。Aschenbach等[59]指出，在断奶犊牛中使用丁酸促进了瘤胃屏障的发育，但是在发育完全的成年牛中过量添加丁酸可能会促进瘤胃过度角化、角化不全和上皮损伤。吴东霖等[60]推荐在哺乳期开食料中添加不包被丁酸钠(0.3%～1.0%干物质)，在生长期饲粮中添加包被丁酸钠，而且丁酸钙的使用效果不及丁酸钠。因此，丁酸对瘤胃上皮细胞的增殖作用是可变的，不仅与丁酸剂量有关，也与丁酸来源(丁酸盐或丁酸酯)、添加形式(受保护或未保护)、添加方法(液体饲料中或固体饲料中)和动物的生理状态有关。

活体试验条件下丁酸促进了瘤胃上皮的发育，但是体外细胞培养的研究结果却相反。两者的不同结果可能与对丁酸及代谢产物反应的激素介质有关。细胞培养条件下，丁酸会抑制瘤胃上皮细胞的生长，当加入生长因子[如胰岛素、胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)、表皮生长因子]时可以克服丁酸对细胞生长的抑制作用[61]。瘤胃上皮细胞的培养研究也证实了IGF-1能够促进细胞的DNA合成和增殖[62]。细胞培养试验发现，丁酸钠增加了瘤胃上皮细胞G0～G1期的细胞比例，降低了S期和G2～M期的细胞比例，表明丁酸有利于上皮细胞处于静止期，抑制细胞增殖，同时发现IGF-1增强了上皮细胞的增殖，并且与丁酸钠具有协同作用[63]。在研究丁酸对瘤胃上皮生长和分化的调控作用时，出现了血浆中一些激素介质的增加，如胰岛素、IGF-1和IGF-1受体[12,47]，以及胰高血糖素样肽(glucagon-like peptide，GLP)-2[47,58]。不同VFA具有在生理环境(pH 6.1)下形成紧密上皮屏障的潜力，但是高浓度丁酸(30 mmol/L)可能有不利影响，而在酸性环境(pH 5.1)下VFA均具有损害瘤胃上皮完整性的作用，丁酸浓度增加后损害更严重[64]。丁酸浓度的大幅度增加会降低瘤胃上皮的选择性通透，导致屏障功能受损[57]。因此，丁酸对上皮细胞生长的调控作用不仅与生长因子(受丁酸及其代谢产物的调控)刺激的细胞生殖有关，也与丁酸浓度、pH、细胞分化状态有关。

2.3.2 对上皮基因和蛋白的影响

作为细胞分子，丁酸诱导着瘤胃上皮细胞约65%基因的转录水平[24]。连续灌注28 d丁酸钠，灌注后5 h时瘤胃上皮中细胞周期蛋白(Cyclin)D1、细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)2、CDK4和CDK6(细胞G0/G1期调节剂)，7 h时CyclinE1(细胞G1/S期调节剂)，以及9 h时CyclinA1和CDK1(细胞S期调节剂)的mRNA表达增强，此外凋亡基因[如含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3、Caspase-9和B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白(Bax)]的mRNA表达在灌注后5 h上调，表明丁酸通过时间依赖性地改变参与细胞增殖和凋亡的基因表达来改善上皮生长[11]。丁酸钠通过增加瘤胃上皮增殖相关基因(如CyclinA2、CyclinD1和CDK6)、降低上皮细胞凋亡相关基因(如Caspase-3和Bax)以及影响内分泌相关基因[如IGF-1受体、胰岛素样生长因子结合蛋白-3(insulin-like growth factor binding protein，IGFBP)-3、IGFBP-5]的mRNA表达，促进瘤胃乳头的生长发育[12]。单羧酸共转运蛋白(monocarboxylate cotransporter isoform，MCT)1和钠/氢交换蛋白(sodium/hydrogen exchanger isoform，NHE)3参与质子输出细胞外，而钠/碳酸氢盐共转运蛋白1(sodium/bicarbonate cotransporter isoform 1，NBC1)参与碳酸氢盐输入细胞内[65]。细胞培养发现丁酸上调瘤胃上皮细胞中MCT1和MCT4的mRNA表达，这些基因在VFA及其代谢产物的转运中发挥作用[18-19]。Liu等[12]也发现丁酸钠增强了瘤胃上皮VFA摄取[如MCT1、NHE2、腺瘤下调(downregulated in adenoma，DRA)]与VFA代谢相关基因的mRNA表达。然而，Malhi等[15]研究显示，灌注丁酸钠3 h后瘤胃上皮中cyclinD1的mRNA表达增加，7 h时恢复至灌注前水平，而CDK4和MCT1、MCT4的mRNA表达没有随着灌注时间发生变化，推测cyclinD1转录的瞬时增加有助于丁酸诱导的乳头生长，并随后导致VFA吸收增加。SARA发生期间，添加丁酸盐增加瘤胃上皮基底膜外侧MCT1的蛋白表达来促进VFA摄取入血，降低NBC1的蛋白表达来减少基底外侧碳酸氢盐摄入细胞，而NBC1降低碳酸氢盐摄入有助于缓解MCT1增加的风险，因为MCT也能从细胞液中释放质子而使细胞内呈碱性[14]。瘤胃上皮细胞中MCT1、NHE1和NHE2以及阴离子交换剂[DRA和假定阴离子转运蛋白1(putative anion transporter 1，PAT1)]的mRNA表达没有差异，但是耐酸中毒牛中NHE3的mRNA表达比酸中毒敏感牛高176%，判断耐酸中毒牛的高瘤胃液pH可能部分是由于VFA吸收速度更快、VFA产生较低或两者兼有[8]。因此，外源丁酸可以改变瘤胃上皮中基因/蛋白的表达，影响上皮的生长发育和膜转运蛋白的可塑性，进而增强VFA吸收和改善瘤胃液pH。

RNA-seq研究显示，灌注丁酸72 h后即导致紧密连接蛋白[(tight junction protein 3，TJP3)和封闭蛋白(claudin)]以及连接黏附分子(junctional adhesion molecule，JAM)2和JAM3的mRNA表达增加，这些基因在维持和/或恢复屏障功能中可能起重要作用[66]。Dionissopoulos等[49]发现丁酸影响参与非特异性宿主防御、基质重塑或适应以及免疫应答相关基因的表达。宿主组织的TLR能够识别细菌的副产物，触发宿主先天免疫应答，促进上皮细胞增殖和屏障功能。瘤胃乳头中TLR2和TLR4在耐酸中毒牛中的mRNA表达高于酸中毒敏感牛，表明耐酸中毒牛的先天性免疫反应高于酸中毒敏感牛[53]。丁酸钠可以增加瘤胃上皮中TLR2和TLR5的mRNA表达，降低白细胞介素(interleukin，IL)-1β和干扰素-γ(interferon-gamma，IFN-γ)的mRNA表达，而TLR信号传导可以抑制促炎性细胞因子的产生[50]。类似报告显示，高精料中添加丁酸钠降低瘤胃促炎细胞因子[如IL-1β、IL-8、IL-10、TLR4、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)]的mRNA表达，以及降低核因子-κB(NF-κB)(p65和磷酸化p65)、IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白表达，降低外周血中IL-1β、IL-6和TNF-α浓度，其水平与低精料饲粮组相似，表明丁酸钠可以减轻高精料饲粮引起的瘤胃上皮的局部炎症和破坏，从而保护上皮的完整性和屏障功能[16]。Zhang等[17]发现，在诱导山羊出现SARA的高精料饲粮中添加丁酸钠降低了蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)活性和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路中部分基因的mRNA表达和磷酸化蛋白水平，表明丁酸钠可以通过抑制PKC和MAPK信号通路来逆转瘤胃上皮紧密连接的损伤。丁酸钠可以通过MAPK路径调控细胞的增殖[67]。在出现SARA的奶牛饲粮中添加丁酸盐显著增加糖酵解和氧化磷酸化相关基因的mRNA表达，降低脂肪生成相关基因的mRNA表达，推断丁酸能够促进瘤胃上皮的能量动员，进而阻止因SARA造成的能量应激[13]。丁酸对饲喂高精料饲粮的反刍动物瘤胃上皮具有保护和免疫增强作用，可以缓解SARA带来的风险。

GPR是可以通过SCFA特异性识别的跨膜受体，它的激活可以引起多种转录因子的活化。丁酸激活GPR，特别是GPR41、GPR43和GPR109A，在代谢、炎症和疾病的调节中起着重要作用[20]。RNA-seq研究发现，丁酸诱导的一些独特表达的基因参与了一些经典路径，如GPR介导的信号传导[21]。蛋白质乙酰化在代谢的转录调控中发挥着主要作用，乙酰基团可由HDAC催化而去除，导致DNA变得紧密结合，进而影响临近基因的表达。丁酸和β-羟丁酸被认为是HDAC抑制剂，在许多基因的启动子上诱导组蛋白乙酰化，调节基因转录，其中涉及多个信号通路，如IFN-γ、TNF-α和NF-κB信号通路[21,24-26]，以及Janus激酶/信号转导和转录激活因子(JAK/STAT)和p38/胞外信号调节激酶(ERK)-MAPK信号通路[67-68]。丁酸通过抑制HDAC导致叉头盒蛋白3(forkhead box protein 3，FOXP3)基因的保守非编码序列区域中组蛋白H3的乙酰化增加，从而增强FOXP3的表达，促进调节性T细胞(regulatory T cell，Treg细胞)的增殖分化，进而增强免疫和抗炎作用[69]。研究发现，GPR和HDAC调节的基因网络主要与维持上皮完整性和促进动物生长有关，丁酸摩尔比例与HDAC1的mRNA表达呈负相关，梭菌属(Clostridum)_Ⅳ细菌丰度与GPR1的mRNA表达呈正相关，表明微生物源的SCFA对上皮细胞生长和代谢的影响是由GPR和HDAC介导的[22]。丁酸通过影响GPR和HDAC发挥的调控作用已成为研究热点。

3 丁酸对小肠的影响

小肠是消化道内的重要器官，主要参与营养物质的消化和吸收。大量可发酵碳水化合物进入后段肠道，可引发后肠酸中毒，其特征是SCFA(包括乳酸)的产生速率增加、消化液pH降低以及肠上皮受损[70]。丁酸不仅是一种重要的营养素，为肠上皮细胞提供能量，促进肠道发育，抑制病原菌生长，并通过多种机制在上皮细胞中充当细胞介质，参与基因调节、免疫调节、细胞分化、肠屏障调节、氧化应激、腹泻控制等生理作用[71]。代乳粉(丁酸钠晶体)和开食料(丁酸钠的三酰甘油胶囊)中添加丁酸钠均会促进新生小牛的小肠发育，其中代乳粉中添加效果更明显[72]。新生犊牛代乳粉中添加丁酸钠促进了肠道的发育成熟，如增加绒毛长度和宽度，增强黏膜厚度[73-74]。吴东霖等[60]总结了在幼龄反刍动物中添加丁酸的效果，发现丁酸能够促进小肠细胞分裂，减少凋亡，刺激肠道绒毛发育。毒素诱导的急性肝衰竭小鼠的肠通透性显著增加，经过丁酸钠处理12或24 h后，肠通透性得到显著改善，血清内毒素含量显著降低[75]。Peng等[76]发现低浓度丁酸钠(2 mmol/L)有利于Caco-2单层细胞的肠屏障功能，而高浓度丁酸钠(8 mmol/L)会导致严重的上皮细胞凋亡并破坏肠道屏障功能，表明丁酸对肠道防御屏障的调控作用依赖于丁酸浓度。丁酸对小肠生长发育和消化吸收能力的改善作用可能受到IGF-1的调控[77]，或者与局部IGF系统的参与有关[73]。GLP-1和GLP-2是由远端肠道L细胞分泌的肠源性肽，在调节血糖稳态、维持黏膜形态以及肠道功能和完整性方面发挥作用。灌注丁酸钠增加了血浆中GLP-1和GLP-2浓度[47]，皮下注射GLP-2显著影响羔羊小肠上皮发育相关基因的表达，促进了小肠发育[78]。丁酸对肠道屏障功能的增强作用是由腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)的激活介导的[79]。也有报道，丁酸钠增加胃和结肠中热休克蛋白(heat-shock protein，HSP)27和HSP70的浓度，从而刺激胃肠道防御系统[77]。丁酸在肠道中具有抗炎作用，主要通过抑制上皮细胞中NF-κB的激活，而NF-κB调控着细胞中一些参与早期免疫炎症应答的基因[80]。丁酸直接或间接作用于肠道组织发育和修复，其直接营养作用体现在细胞增殖方面，间接作用涉及激素-神经-免疫系统，并且通过直接影响毒力基因表达和影响宿主细胞增殖而参与细菌毒力的下调。

丁酸在肠道屏障功能的维持方面与GPR和HDAC也有关系。高精料中补充丁酸钠下调盲肠GPR41/43和相关炎症细胞因子的mRNA表达，上调紧密连接蛋白[闭锁小带蛋白-1(ZO-1)和闭锁蛋白(Occludin)]的mRNA表达，以及降低GPR41/43、ERK1/2和p38的蛋白表达，并改变GPR41/43基因启动子区域中DNA甲基化和染色质紧缩的比率，表明丁酸钠可以减少盲肠黏膜的炎性损伤，并通过表观遗传修饰影响GPR41/43的表达[23]。丁酸处理经过LPS刺激的肠巨噬细胞，导致促炎性介质(包括一氧化氮、IL-6和IL-12)含量下降，未影响TLR下游信号通路(NF-κB和MAPK)和GPR(GPR109A和GPR43)的表达水平，而染色质免疫沉淀分析显示丁酸导致一氧化氮合酶(nitric oxide synthase 2，NOS2)、IL-6和IL-12b启动子区域的组蛋白3赖氨酸9乙酰化(H3K9Ac)水平升高，表明丁酸的作用与TLR信号转导和GPR激活无关，而是通过抑制HDAC来调控肠巨噬细胞功能[81]。基因缺失小鼠的研究表明，HDAC1和HDAC2通过调控肠上皮细胞的增殖和分化来抑制肠的炎症反应[82]。存在于结肠隐窝底部的低中等浓度丁酸很容易在线粒体内代谢，促进细胞增殖，而肠腔中高浓度丁酸超过了结肠细胞的代谢能力，未代谢的丁酸进入细胞核并作为HDAC抑制剂起作用，在表观遗传学上调节基因表达以抑制细胞增殖，并在细胞脱落至肠腔时诱导凋亡[25]。

4 丁酸对肝脏的影响

肝脏是机体重要的免疫器官，参与机体的营养重分配、解毒和免疫调节等。丁酸钠处理山羊肝脏原代细胞，发现细胞活力显著增加，糖代谢相关基因(葡萄糖六磷酸酶和丙酮酸激酶)的mRNA表达显著降低，而糖异生相关蛋白(AMPK和磷酸化AMPK)的表达显著增加[83]。丁酸钠也可以改善毒素诱导的急性肝衰竭小鼠肝脏的病理学变化，抑制肝组织中高迁移率族蛋白B1(high mobility group box-1，HMGB1)和NF-κB p65的蛋白表达，降低血清中内毒素和免疫细胞因子水平，从而延长存活期[75]。SARA状态下瘤胃内革兰氏阴性菌裂解释放的大量内毒素通过受损的瘤胃上皮吸收入血，经门静脉进入肝脏，超过肝脏的清除能力时会造成肝脏的炎性损伤。SARA被认为是引起肝脏脓肿的诱发因素[2]。丁酸钠能够缓解饲喂高精料导致的肝脏功能损伤和细胞凋亡程度，体现在门静脉和肝静脉中LPS以及外周血中炎性因子含量降低，TNF-α和促凋亡基因(Caspase-3、Caspase-8、Bax)的mRNA表达下调，以及NF-κB(p65和磷酸化p65)、Caspase-3、Bax和细胞色素C的蛋白表达下调[37]。类似研究显示，高谷物饲粮中添加丁酸钠，瘤胃、门静脉和肝脏中LPS以及外周血中促炎细胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)含量降低，肝脏的抗氧化能力和抗氧化酶活性增强，核因子E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)基因的mRNA和蛋白表达水平以及Nrf2目标基因的mRNA表达水平均升高，提示丁酸钠可以通过部分激活Nrf2依赖性基因来改善SARA的氧化状态[36]。SARA发生期间，饲粮中添加丁酸钠降低瘤胃中iE-DAP(大多数革兰氏阴性细菌和某些革兰氏阳性细菌的细胞壁肽聚糖的常见成分)浓度，同时抑制炎症基因的mRNA表达，以及下调含核苷酸结合寡聚化域蛋白1(nucleotide-binding oligomerization domain-containing protein 1，NOD1)和磷酸化MAPK的蛋白表达，进而缓解高精料引起的iE-DAP诱导的炎症和肝脏破坏[84]。丁酸钠存在通过GPR41受体调节山羊肝脏细胞功能的机制[83]。丁酸钠也能降低SARA山羊肝脏中HADC3的蛋白表达和炎症因子水平，提示HDAC可能在丁酸缓解肝脏炎症中起作用[84]。因此，丁酸具有缓解SARA对肝脏损害，提高机体免疫机能的潜力。

5 小 结

丁酸作为微生物发酵产物之一，影响着瘤胃液pH和微生物区系以及发酵/代谢产物。同时，丁酸作为瘤胃和肠上皮细胞的首选能量来源，促进上皮的生长与发育，增强营养素的吸收和胃肠道的屏障功能，进而有助于维持瘤胃液pH以及胃肠道和血液中低水平的炎症因子。分子水平上，丁酸通过改变瘤胃上皮中相关基因和蛋白的表达，促进乳头的生长发育，增强VFA吸收和改善瘤胃液pH，以及保护上皮的完整性和屏障功能。同样，丁酸通过下调肠上皮和肝脏中NF-κB、TNF-α和促凋亡基因的表达，上调紧密连接蛋白等的表达，提高免疫机能，减少炎性损伤和细胞凋亡程度。丁酸诱导的一些基因参与了GPR介导的信号传导，通过激活GPR，或者通过表观遗传修饰影响GPR表达，进而引起多种转录因子的活化，调控代谢路径和减少炎症反应。丁酸与代谢产物β-羟丁酸作为HDAC抑制剂在基因表达的表观遗传调控中发挥作用，涉及细胞功能(包括细胞形态变化、细胞周期停滞和凋亡)、信号转导、机体免疫。因此，丁酸不仅作为细胞的能量，也作为信号分子参与多个信号通路，如IFN-γ、TNF-α和NF-κB信号通路，以及JAK/STAT和p38/ERK MAPK信号通路，缓解高精料饲粮(易诱发SARA)带来的风险。但是，高浓度丁酸不利于微生物发酵，也会降低上皮细胞的选择通透性，破坏胃肠道的屏障功能，而且在长期的低pH环境下损害会更严重。

随着高通量测序技术和质谱技术以及生物信息学的快速发展和广泛利用，生命科学领域已进入以多组学(基因组/转录组学、宏基因组/转录组学、蛋白质组学、代谢组学、免疫组学、饲料组学等)为特征的大数据时代，极大地提高了人们对宿主基因和蛋白表达、微生物群落组成和功能的认知，有助于探讨微生物与宿主之间的关系。如利用16S rRNA基因测序和代谢组发现，饲喂高谷物饲粮时瘤胃微生物的多样性降低[43,85]，瘤胃出现大量丁酸产生菌[43,51]，瘤胃中氨基酸(赖氨酸、亮氨酸、缬氨酸)、VFA(丁酸和丙酸)以及有毒和炎性化合物(腐胺、甲胺、乙醇胺和脂多糖)含量增加[42-43]，瘤胃-肝脏-血清中的代谢变化主要与氨基酸代谢有关[85]。RNA-seq研究表明，丁酸诱导多数基因的转录水平发生变化[21,24,66]，通过激活GPR或者作为HDAC抑制剂影响多个信号通路[21-22,24]。结合16S rRNA基因测序，认为微生物-GPR轴和微生物-HDAC轴可能是介导SCFA生理作用的主要途径[22]。因此，组学技术的利用，尤其是多部位、多组学结果的联合分析有利于全面认识微生物与宿主之间的关系，有助于揭示丁酸在胃肠道代谢和机体免疫中的调控机理。