长时期饲喂杂粕型饲粮对蛋鸭产蛋性能、生殖器官及卵巢激素受体mRNA表达水平的影响

黄雪冰 张罕星 李凯潮 王 爽 夏伟光 张亚男 王胜林 林映才 陈 伟 郑春田

(广东省农业科学院动物科学研究所，畜禽育种国家重点实验室，农业农村部华南动物营养与饲料重点实验室，广东省畜禽育种与营养研究重点实验室，广州 510640)

豆粕型饲粮在畜禽养殖生产中被广泛使用，由于原料玉米、豆粕等长期依赖进口，增加了饲料成本，寻求可代替豆粕和玉米的饲料原料资源显得尤为重要。我国棉花和油菜种植面积广，产量大，经榨油后产生大量的棉籽粕和菜籽粕，粗蛋白质含量均为40%左右，是较优的蛋白质原料[1-2]。玉米干酒糟及其可溶物(distillers dried grains with solubles, DDGS)是玉米在生产酒精过程中的副产品，因其粗蛋白质含量高(是玉米的3倍以上)、产量大，因而作为常规饲料原料的重要替代品在生产中应用也越来越广泛[3]。木薯干淀粉含量为81%～88%，是优质的能量原料[4]。研究表明，在28～40周龄海兰商品蛋鸡的饲粮中添加25%未脱毒棉籽粕对产蛋率、平均蛋重、日产蛋重、料蛋比、平均采食量及死淘率均无显著影响[5]。产蛋鸡饲粮中分别应用4%、8%和10%双低菜籽粕替代等量豆粕对生产性能无显著影响[6]。饲粮中添加12%的菜籽粕替代部分豆粕不影响肉种鸡的产蛋率和蛋重，还提高了种蛋受精率[7]。蛋鸡饲粮中应用20%的玉米DDGS对生产性能没有不良影响[8]。研究发现，在产蛋期蛋鸡饲粮中，木薯粉可以替代50%的玉米，换羽期可完全替代玉米[9-10]。阮栋等[11]报道，饲粮中添加9%棉籽粕对蛋鸭产蛋性能无显著影响；Ruan等[12]分别在饲粮中添加8%菜籽粕和高达18%的玉米DDGS对蛋鸭的产蛋性能无显著影响。以上研究表明，饲粮中应用适量非常规原料对蛋禽生产性能不会产生负面影响。我国蛋鸭养殖规模位居世界首位，年存栏量约2亿只，年产鸭蛋400万t，蛋鸭生产中大量应用非常规原料以节省成本，但目前仍不清楚长时期应用杂粕型饲粮(非常规饲料)对蛋鸭生产性能及机体健康是否会产生负面影响。因此，本试验旨在通过对蛋鸭长时期饲喂杂粕型饲粮，研究其对蛋鸭产蛋性能、生殖器官及卵巢激素受体mRNA表达水平的影响，评价长时期饲喂杂粕对蛋鸭机体健康影响，为杂粕型饲粮在蛋鸭饲料中应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

选择健康的19周龄福建龙岩麻鸭360羽，按体重随机分为2组，每组6个重复，每个重复30只鸭[体重与品种标准体重差异<10%，各重复初始体重无显著差异(P>0.05)]，采用地面+水域方式饲养。豆粕组(对照组)饲喂豆粕型饲粮，杂粕组饲喂杂粕型饲粮，其组成及营养水平见表1，2组饲粮能量、粗蛋白质、氨基酸(赖氨酸、蛋氨酸、色氨酸、苏氨酸)含量一致。

表1 饲粮组成及营养水平(风干基础)

1.2 动物饲养与管理

试验鸭在试验场(水域面积∶陆地面积=1∶3)地面平养，试验期间，每天07:00和16:00各喂料1次，所有栏试验鸭自由采食饮水。按常规程序免疫和常规操作规程饲养。试验持续12个月，试验前预饲1周。试验期间，鸭舍光照保持16 h/d，晚上日光灯补光到22:00。

1.3 指标测定

1.3.1 产蛋性能

每天准确记录给料量和剩料量，统计试验期间的平均日采食量。记录各重复栏鸭每天蛋重、产蛋数量、破蛋数量(大小、形状、蛋壳正常，但被试验鸭踩破的蛋)、畸形蛋数量(大小、形状、蛋壳不正常，如过大、过小、形状不规则、软壳、麻壳、裂纹等)和耗料量，统计平均日增重、平均日采食量、产蛋率、平均蛋重、日产蛋重、料蛋比、破蛋率、畸形蛋率。

1.3.2 样品采集

试验结束时，试验鸭空腹12 h后，从各重复栏中选取2只蛋鸭颈部放血致死，打开腹腔，剪断卵巢系膜，取下卵巢称重，记录优势卵泡(直径大于10 mm)数量和重量，计算优势卵泡总重与卵巢重的比值。测量输卵管长度和重量。采集输卵管、卵巢、肝脏、肾脏、小肠等样品于液氮速冻后-80 ℃保存，并采集输卵管和卵巢样品在10%中性福尔马林溶液中4 ℃保存。

1.3.3 组织形态指标

输卵管、卵巢组织固定48 h后，经修块、脱水、包埋、切片、石蜡切片脱蜡至水、苏木素染细胞核、伊红染细胞质、脱水封片等步骤，在光学显微镜(Nikon Eclipse Ni-E，日本)下观测取图，采用Motic Images图像分析系统，测定输卵管和卵巢的组织形态变化。

1.3.4 组织游离棉酚残留检测

肝脏、肾脏、卵巢、输卵管、小肠中游离棉酚含量测定参考阮栋等[11]的方法，采用高效液相色谱仪(Waters 2695，美国)测定。分离条件：Waters XBridge C18柱(4.6 mm×250 mm×5 μm)，柱温25 ℃，流动相为甲醇-水，每100 mL溶液含0.1 mL磷酸，流速0.8 mL/min，Waters 2489紫外检测器，检测波长为236 nm，检测限为1.0 mg/kg。棉酚对照品(批号111517-200001，规格20 mg)购自广州药品检验所。

1.3.5 RNA提取及荧光定量PCR反应

采用Trizol法提取卵巢组织样品RNA后用ND-1000紫外分光光度计(Nanodrop，美国)在OD260和OD280下检测RNA的浓度和纯度，RNA反转录合成cDNA，并进行荧光定量PCR，以β-肌动蛋白(β-actin)基因为内参，用2-△△Ct计算mRNA相对表达量。采用Primer Premier 5软件设计卵泡激素受体(follicle-stimulating hormone receptor,FSHR)、黄体生成素受体(luteinizing hormone receptor,LHR)、雌激素受体1(estrogen receptor 1,ER1)和β-actin基因引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成，实时荧光定量PCR引物信息见表2。

表2 实时荧光定量PCR引物信息

1.4 统计分析

试验数据采用GraphPad Prism 7.0进行t检验，结果以平均值和均值标准误表示，P<0.05表示组间差异显著。

2 结 果

2.1 杂粕型饲粮对蛋鸭产蛋性能的影响

如表3所示，相比豆粕型饲粮，饲喂杂粕型饲粮的蛋鸭产蛋率、平均蛋重、日产蛋重显著下降(P<0.05)，料蛋比显著上升(P<0.05)。图1-A是连续12个月饲喂杂粕型饲粮蛋鸭产蛋率每月变化曲线图，结果发现蛋鸭饲喂杂粕型饲粮期间产蛋率低于豆粕型饲粮，尤其在换羽期(4～5月)产蛋率明显下降。图1-B是饲喂杂粕型饲粮期间蛋鸭每月平均蛋重变化趋势，发现蛋鸭饲喂杂粕型饲粮后，从1～5月连续5个月的平均蛋重低于豆粕组。图1-C是饲喂杂粕型饲粮期间蛋鸭每月日产蛋重变化趋势，相比豆粕组，杂粕组蛋鸭从11月到次年6月连续8个月的日产蛋重下降明显。

表3 杂粕型饲粮对蛋鸭产蛋性能的影响

图1 饲喂杂粕型饲粮蛋鸭产蛋率、平均蛋重和日产蛋重的变化趋势

2.2 杂粕型饲粮对蛋鸭生殖器官的影响

如表4所示，与豆粕组相比，饲喂杂粕型饲粮长达12个月后对蛋鸭输卵管长度、输卵管重、卵巢重、优势卵泡个数、优势卵泡重均无显著影响(P>0.05)，但有降低优势卵泡重/卵巢重的趋势(P=0.083)。组织切片结果如图2所示，饲喂豆粕型饲粮蛋鸭输卵管固有层内可见较多血管，未见炎性细胞浸润，卵巢皮质可见各级卵母细胞，发育良好，未见明显的退行性改变。饲喂杂粕型饲粮蛋鸭输卵管的黏膜固有层水肿明显，腺管体积缩小，卵巢中原始卵泡增多。

表4 杂粕型饲粮对蛋鸭生殖器官的影响

图2 杂粕型饲粮对蛋鸭输卵管和卵巢组织形态的影响

2.3 饲喂杂粕饲粮蛋鸭组织器官中棉酚残留情况

如表5所示，对蛋鸭组织器官中棉酚残留检测发现，豆粕组蛋鸭肝脏、肾脏、卵巢、输卵管、小肠等组织器官中均未检测出棉酚的残留；饲喂杂粕型饲粮蛋鸭肝脏中棉酚残留量最高，达到81.28 mg/kg，其次肾脏中棉酚残留量为34.70 mg/kg，卵巢和输卵管中棉酚残留量分别为13.28和10.88 mg/kg，在小肠中的残留量为3.78 mg/kg。

表5 饲喂杂粕型饲粮蛋鸭组织器官中棉酚残留情况

2.4 杂粕型饲粮对蛋鸭卵巢激素受体mRNA表达水平的影响

如表6所示，相比豆粕型饲粮，杂粕组蛋鸭卵巢组织中FSHR、LHRmRNA相对表达量显著下降(P<0.05)，同时ER1 mRNA相对表达量有下降趋势(P=0.080)。

表6 杂粕型饲粮对蛋鸭卵巢激素受体mRNA相对表达量的影响

3 讨 论

3.1 杂粕型饲粮对蛋鸭产蛋性能的影响

本试验发现，饲喂杂粕型饲粮12个月显著降低了高峰期蛋鸭产蛋率、平均蛋重、日产蛋重，同时提高了料蛋比。此结果与单独在饲粮中添加某一种非常规饲料原料对蛋鸭产蛋性能的影响不尽相同。阮栋等[11]报道，饲粮中添加9%棉籽粕饲喂3个月，发现对蛋鸭产蛋性能无显著影响，但高于9%棉籽粕对蛋鸭产蛋性能产生负面影响，如降低蛋重、提高料蛋比等。Ruan等[2]用8%的菜籽粕添加到蛋鸭饲粮中饲喂4个月，发现其对产蛋量、平均蛋重和饲料转化率无显著影响。Ruan等[12]报道，蛋鸭饲粮中添加高达18%玉米DDGS不会影响蛋鸭的产蛋量、蛋重、饲料转化率，平均蛋重随饲粮中玉米DDGS添加水平增加而线性下降，试验期为18周。罗威才[3]研究发现，饲喂金定蛋鸭1个月高达24%的玉米DDGS对产蛋率无显著影响，当添加水平为24%时料蛋比有增加的趋势。可见单独在饲粮中添加某一种非常规饲料原料对蛋鸭的产蛋性能影响不显著，且添加剂量也较大，与本研究结果有差异，可能是由于试验时间长短及单因子处理未能引起蛋鸭产蛋性能有明显的变化。孙静等[13]用8%～20%棉籽粕和8%～20%菜籽粕组合饲喂蛋鸭52 d，发现蛋重表现出不同程度的下降，并建议添加12%菜籽粕以及不高于8%的棉籽粕对鸭蛋加工皮蛋最适宜。在接近单独添加某一种原料的剂量之下，联合使用后对蛋鸭的产蛋性能有一定的叠加效应。相似的结果表现在蛋鸡的研究上，何斌[14]研究用不同水平棉籽粕(1.2%、2.4%、4.8%、9.6%、11.9%)饲粮饲喂34周龄罗曼粉壳蛋鸡12周，结果发现饲粮棉籽粕添加水平对蛋鸡产蛋率、料蛋比无显著影响，当棉籽粕添加水平超过9.6%时显著降低蛋重。陈连颐等[15]研究发现，在海赛克斯蛋鸡饲粮中添加5%～15%棉籽粕10周，蛋鸡平均产蛋率、平均蛋重、料蛋比与对照组相比有下降的趋势。Panigrahi等[16]报道，用不同水平棉籽粕(75、150、300 g/kg)饲粮饲喂蛋鸡10周，棉籽粕水平达到300 g/kg(游离棉酚含量255 mg/kg)时，蛋鸡产蛋量显著降低。Mu等[17]发现饲粮中添加12%棉籽粕饲喂8周，降低了蛋鸡的产蛋率和饲料效率。Yuan等[18]发现，蛋鸡饲喂含有6%棉籽粕饲粮8周，显著降低了平均蛋重，并提高了料蛋比。王丽娟等[19]在海兰褐蛋鸡饲粮中应用6.3%棉籽粕和5%菜籽粕70 d，发现产蛋率、平均蛋重、产蛋量显著下降，料蛋比显著上升。研究发现，在40周龄蛋鸡饲粮中添加8%玉米DDGS和30%木薯粉35 d，显著降低了蛋鸡产蛋量和饲料转化率[20]。通过以上杂粕饲粮在蛋鸭与蛋鸡的应用试验，可以发现杂粕应用剂量及物种会造成试验结果的差异，同时本试验与以上试验差异的因素还可能与试验时间长短和杂粕应用组合效应有关。

3.2 杂粕型饲粮对蛋鸭生殖器官的影响

在本试验中，饲喂杂粕型饲粮长达12个月对蛋鸭输卵管长度、输卵管重、卵巢重、优势卵泡个数、优势卵泡重均无显著影响，但优势卵泡重/卵巢重有降低的趋势。组织器官形态学分析发现，饲喂玉米-豆粕型饲粮蛋鸭输卵管固有层内可见较多血管，卵巢发育良好，而饲喂杂粕型饲粮蛋鸭输卵管的黏膜固有层水肿明显，腺管体积缩小，卵巢中原始卵泡增多。这表明长时期饲喂杂粕型饲粮对蛋鸭生殖器官(卵巢和输卵管)产生了负面影响。阮栋等[11]发现饲粮中9%及以上的棉籽粕3个月会明显破坏蛋鸭优势卵泡的完整性，使得卵泡变形破裂，局部呈融溶状。何斌[14]研究发现，蛋鸡饲粮中应用9.6%和11.9%棉籽粕3个月，可引起输卵管膨大部和子宫部空泡变性。同时研究发现，饲粮中添加2.5%菜籽油可导致蛋鸡卵泡出血，蛋黄比例降低[21]。游离棉酚是棉籽粕中的主要抗营养因子，能损害肝脏、肾脏、卵巢、输卵管等实质器官，由于其代谢缓慢，易在动物体内蓄积，可造成长期损害[22]。本试验发现，杂粕组中蛋鸭的肝脏、肾脏、卵巢、输卵管中都有不同程度的棉酚残留，这可能是造成输卵管和卵巢损伤的原因之一。滑鹏欢等[23]的研究发现，蛋鸡饲粮中棉籽粕的添加量超过100 g/kg会影响生产性能，鸡蛋中游离棉酚残留量会随游离棉酚的摄入量的增加而增加，随着饲养期限(24周)的延长，鸡蛋中的游离棉酚残留率会提高。焦洪超等[24]用含游离棉酚20和40 mg/kg的饲粮分别饲喂蛋鸡，蛋鸡饲喂5、25和45周后，其肝脏中游离棉酚的含量分别为60、185、462 mg/kg和462、642、955 mg/kg，由此表明，长时间饲喂含有棉籽粕的杂粕饲粮提高了游离棉酚在动物机体的残留率，蓄积作用明显。菜籽粕中的硫葡萄糖苷和芥酸含量直接影响其在畜禽饲粮中的添加量，未脱毒处理时菜籽粕饲粮添加量在5%～15%为宜，脱毒处理后，双低菜籽粕的使用量可提高至10%～20%[6]。玉米DDGS会浓缩玉米中的霉菌毒素，其中玉米赤霉烯酮是一种类雌激素活性的毒素，主要危害畜禽生殖系统[25]。用于加工成木薯干的苦味木薯会含有较高含量的氢氰酸等抗营养因子[4]。我们推测，长时期应用杂粕型饲粮对蛋鸭生殖器官造成不良影响有可能是几种非常规原料中抗营养因子联合作用的结果，但仍有待进一步确定。

3.3 杂粕型饲粮对蛋鸭卵巢激素受体mRNA表达水平的影响

本试验通过对卵巢激素受体mRNA的相对表达量检测发现，相比豆粕型饲粮，杂粕型饲粮显著下调了FSHR、LHRmRNA相对表达量，同时有降低ER1 mRNA相对表达量趋势。FSHR对卵泡的发育、成熟、排卵发挥着重要的作用[26-27]。有研究表明，杂种蛋鸡中FSHR基因差异表达量可能是导致产蛋数量差异的重要因素[28]。此外，FSHR可通过介导环腺苷酸(cAMP)途径发挥激素促卵泡成熟作用，卵泡激素(FSH)与颗粒细胞表达的FSHR结合后，使得芳香化酶活化，同时诱导LHR生成，诱发动物体排卵[29]。刘立文等[30]研究发现FSHR和LHR表达量下降，会导致柴鸡的卵泡发育减缓，从而使得家禽的性成熟推迟。ER是卵母细胞胞质中的信号转导分子，能够通过调节类固醇激素分泌从而促进卵母细胞的发育和成熟[29,31]。本试验结果表明，饲喂杂粕型饲粮的蛋鸭产蛋率下降，可能与卵巢激素受体FSHR、LHR、ER1的mRNA相对表达量下降有关。

4 结 论

蛋鸭饲喂杂粕型饲粮12个月可造成产蛋性能下降，可能与其中含有的抗营养因子通过抑制蛋鸭生殖器官生长，同时降低卵巢激素受体mRNA表达水平有关。