间充质干细胞来源的细胞外囊泡用于骨关节炎治疗的研究进展

蔡龙云 林宗汉

【摘要】骨性关节炎是一种关节退行性疾病，随着人口老龄化问题的加重，该疾病的发病率也呈现出逐渐上升的趋势，成为全球医学界普遍面临的医疗难题。间充质干细胞的来源的细胞外囊泡是目前关于骨关节炎治疗的一项新型研究。本文对细胞外囊泡的的生物学特点、作用机制、增强其作用效果的预处理策略及干细胞来源和特性等方面的研究进展作一总结，论述其未来运用的可能性。

【关键词】骨关节炎;间充质干细胞;细胞外囊泡;综述

【中图分类号】R684.3  【文献标识码】A   【文章编号】2026-5328（2021）01-113-05

1.前言：

骨性关节炎（OA） 是一种涉及整个关节的慢性退行性疾病，其主要病理改变是关节滑膜炎症，软骨退化、缺损，软骨下骨再生及骨赘形成。目前的观点认为，骨关节炎的发病基于关节组织的损伤和修复之间复杂生理关系的失衡，而不是一种简单的机械性改变。近些年来，间充质干细胞（MSC）被越来越多地运用到骨关节炎的治疗研究中。而细胞外囊泡作为MSC旁分泌作用的重要载体包含亲代细胞的关键表面标志物和信号分子并且具有类似的抗炎和营养特性，能起到和MSC同样的治疗作用，因此基于 MSC旁分泌作用的去细胞研究逐渐成为OA治疗的新领域。

2.细胞外囊泡概述：

细胞外囊泡（EV）是指从细胞膜上脱落或者由细胞分泌的具有双层膜结构的囊泡小体，根据其大小和释放方式可以大致分为3种类型：外泌体（直径30～100nm）、微囊泡（直径100～1000nm）和凋亡小体（直径50～4000nm）。外泌体起源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到细胞外基质中;而微囊泡是由细胞膜的向外出芽产生。它们携带的多种蛋白质、脂类、DNA、mRNA、miRNA等反映了亲代细胞的生物学状态，通过受体-配体相互作用，直接膜融合和内吞作用等三種方式作为信号传导复合物在细胞间发挥作用，介导靶细胞活化[1]。与MSC相比EV自身不具有增殖特性，同时易于生产、保存和转移、静脉注射更加安全、免疫原性更低，因此更适合作为疾病治疗的工具。

3. EV在OA治疗中的作用

3.1 EV减轻OA炎症反应

炎症是贯穿OA过程始终的最主要的病理变化，目前普遍认为IL-1β、TNF-α和IL-6在OA病理变化中起主要作用，而NF-κB信号通路作为细胞炎症反应和免疫应答的关键通路，通过介导以上炎症因子的产生也在OA进程中起关键作用。

已经观察到MSC来源的EV可以下调TNF-α、IL-6、NF-κB和IFN-γ的mRNA表达[2]，这表明EV可以通过直接抑制炎症因子的表达以及干预NF-κB信号通路来减轻炎症。EV分泌的肝细胞生长因子（HGF）通过阻止激活的p65NF-κB与RANTES启动子中的κB元素结合从而阻止trans激活其靶基因的转录，阻断NF-κB信号传导[3];TGFBI也可以通过稳定NF-κB抑制剂IκBα，负调控Toll样受体等减少NF-κB信号传导[4][5]。此外，NF-κB作为TLR信号通路下游的转录因子之一也受TLR信号的激活，目前已经发现多种miRNA（miR-146a、miR-146b、miR-497、miR-106a、miR-20b、miR-21等）通过作用于TLR-NF-κB途径上的不同位点如MyD88、IRAK1、TRAF6、IRAK4等来负调控该信号的激活[6]。由此可知EV对OA炎症的抑制可以通过其旁分泌作用中的多种细胞因子及miRNA对NF-κB信号通路的干预来实现。

3.2 EV对OA的免疫调节作用

目前研究认为软骨组织的损伤或老化所形成的组织微碎片以及年龄、肥胖等因素均可能诱发关节内的自身免疫过程，这一过程主要由滑膜组织中多种免疫细胞、补体系统等介导，激活一系列炎症信号通路，引起炎症因子及组织蛋白酶的释放，加重软骨损伤[7]。其中巨噬细胞在该过程中起主要作用，尤其是经典型巨噬细胞（M1），通过产生各种促炎细胞因子加剧滑膜炎症，同时可以激活滑膜成纤维细胞释放MMPs。相反替代性活化巨噬细胞（M2）则被认为具有抗炎和组织修复特性。此外，树突状细胞（DC）、T细胞、B细胞及自然杀伤细胞（NK）等也不同程度参与关节内免疫反应，而现有的研究表明EV对上述免疫细胞均有不同程度的抑制作用[8]。

MSC衍生的EV内含有多种免疫调节因子，如TGF-β、HGF、IDO-1、IL-1O、IL-1RA等，这些因子抑制并减轻NK细胞的增殖和细胞毒性;减少辅助型T细胞Th1和Th17的产生并且抑制Th1和Th17细胞中免疫抑制Treg的转化;抑制IL-1和IL-1R的结合;调节TNF-α的局部浓度，减少NFκB的激活[9]。尤其是对OA中巨噬细胞的作用调节已在大量的研究中证明，IL-10、PGE2和IDO等可溶性因子等通过不同的方式促进M1型巨噬细胞向M2型极化同时进一步影响其他免疫细胞的增殖、分化，抑制炎症反应，促进组织修复[10];另外，EV中的多种miRNA也参与巨噬细胞极化的调节，如：miR-146、miR-216a-5p、miR-27a-3p、let-7b、miR-182等[11] 。总之，EV通过上述免疫调节作用有利于减缓OA进程，促进组织修复;同时这种自身免疫调节一定程度上也解释了其在进入人体后的相对安全性，因为到目前为止尚未有人体和动物试验中EV植入后明显免疫反应的报道。

3.3 EV对软骨降解酶的抑制作用

我们已经发现人类关节透明软骨由95%的细胞外基质（ECM）和仅5%的稀疏分布的软骨细胞组成，而细胞外基质则主要由II型胶原蛋白和蛋白聚糖组成。从OA的长期病理进程来看，早期以胶原蛋白的降解为主，后期则是蛋白聚糖的降解。MMPs和ADMATs是两类在OA软骨退化中其主要作用的降解酶，分别负责上述II型胶原蛋白和蛋白聚糖的降解。

NF-κB可以直接或间接诱导基质降解酶和其他OA相关因子的表达，从而导致异常的软骨分解代谢途径。 NF-κB通过位于MMP1、MMP9和ADAMTS5基因启动子中的NF-κB反应元件诱导分解代谢基因的表达，并促进OA主要促炎和破坏性介质的表达，包括COX2、PGE2和INOS。此外NF-κB信号的激活可以上调ELK1和ELF3、HIF-2α等转录因子而诱导上述降解酶类表达。如活化的HIF-2α通过与位于分解基因启动子中的HIF-2α结合基序结合，促进基质降解酶的表达;此外，HIF2α的靶基因CCAAT/增强子结合蛋白β（C/EBPβ）也可通过直接诱导MMP13的表达而加重OA的进展[12]。通过对NF-κB信号通路与基质降解酶关系的发现，结合前面论述表明EV通过对多种炎症因子及NF-κB信号通路的抑制而减少MMPs和ADAMTs的表达。此外，EV直接分泌的TIMP3可紧密结合与细胞外基质中，抑制多种MMPs对软骨细胞外基质的降解[13];PAI-1作为两种纤溶酶原激活物uPA和tPA的主要生理抑制剂，也能抑制纤溶酶依赖性MMPs的激活，因而一定程度上减少MMPs对ECM蛋白的降解[14]。

3.4 EV对软骨组织的营养修复作用

除了以上叙述的抗炎和降解酶抑制作用外，EV也分泌多种营养因子促进细胞增殖并触发内源性软骨修复分子的形成。TGF-β、IGF-1等可以刺激蛋白聚糖、COL2A1、COMP、HA等软骨细胞外基质主要成分的产生，同时减轻OA炎症反应，调节软骨细胞肥大，从而在软骨细胞发育和细胞稳态调节中发挥重要作用[15][16]。bFGF本身则是软骨细胞外基质中较为丰富的一种细胞因子，通过与细胞表面受体结合而激活合成代谢途径，抑制聚集蛋白聚糖酶的活性[17]。骨形态生发蛋白（BMPs）作为TGF-β家族成员之一，同样可以由EV分泌，其中BMP2、BMP3、BMP4、BMP6、BMP7、BMP9等均对软骨的形成和修复具有促进作用[17]。总之，EV通过将多种蛋白因子传递到关节软骨损伤部位，发挥其抗炎及营养作用促进软骨组织的修复。

4.EV治疗作用改善的策略

一些针对ASC的研究发现，经炎性条件下的预处理能够在一定程度上增强EV的免疫调节作用，并且目前认为该作用机制至少部分归因于EV中部分miRNA（miR-34a-5p、miR-146a-5p、miR-21-5p）表达的上调以及这些miRNA介导的M1型巨噬细胞向M2型的极化[18]。缺氧预处理也是目前运用较多的方式，刘宏斌等的一项研究表明低氧条件下培养的ASC分泌更多的EV，并且引起一系列特殊的miRNAs的表达改变，尤其是和亲代MSC相比差异化表达的miRNAs优先调控机体细胞的黏附、细胞分化、细胞增殖、转运和凋亡等生物学功能，提示其在组织损伤和修复中的重要作用[19]。

通过使EV中某些作用机制明确的miRNA的过表达来增强治疗作用的尝试也在不同类型的MSC中开展。如彭凯等采用慢病毒转染法将用miR-140-5p转染人脐带间充质干细胞（huc-MSC），结果表明过表达miR-140-5p的huc-MSC通过抑制NLRP3、caspase-1、MMP-13和ADAMTs-5的表达从而显著抑制骨关节炎大鼠的软骨退变并显著提高软骨修复能力[20]。Mao等采用miR-92a-3p转染人BMSC，使其在BMSC外泌体中高表达，通过miR-92a-3p对wnt5A直接的靶向抑制作用促进软骨基质蛋白，COL2A1和COMP的表达，抑制MMP13的表达[21]。以上研究为将来EV用于临床治疗提供了进一步的研究方向，通过人为的方式干预EV的作用机制，使其产生更好的治疗效果。

5.EV的不同来源及特点

EV的来源广泛，几乎可以由所有类型细胞产生，尽管目前较为一致地认为MSC是用于产生EV的最佳细胞源，但是来源于骨髓、脂肪组织、脐带、滑膜、沃顿氏胶样组织、胚胎干细胞、诱导型多能干细胞（iPSC）等组织细胞的EV在内容物组成及功能疗效等方面也存在差异。

骨髓间充质干细胞（BMSC）目前被认为是MSC治疗领域的金标准。已经发现BMSC-EV能够重新诱导成熟关节软骨细胞标记物的表达，同时减少分解代谢标记物和炎症标记物的表达，抑制巨噬细胞活化，诱导M2巨噬细胞表型的产生，从而保护软骨细胞免于诱导凋亡[22]。但是其在获取上的较高侵入性、相对较低的增殖潜力以及供体年龄在细胞存活、增殖和分化潜能方面的影响，似乎提示其难以成为最理想的细胞源[23]。

脂肪间充质干细胞（ASC）和BMSC来源的EV似乎表现出相似的治疗作用，但ASC-EV的优势在于其获取方式上侵入性更小，也更易获得，有研究发现脂肪组织中有核细胞的1–10%是ASC，而骨髓中BMSC的占比只有0.0001–0.01%[24];其次，ASC本身具有更高的分化潜力以及更长久的离体扩增能力，能够耐受缺血、缺氧的软骨微环境引起的细胞凋亡，从而表现出更优越的治疗效果[22]。然而，有限的研究发现，不同类型和不同部位的脂肪组织在MSC含量和分化能力上存在差异，而目前来讲最佳的获取部位还需要进一步的研究确认[25]。

胚胎间充质干细胞（ESC-MSC）具有比其他类型MSC更高的自我增殖能力、多项分化能力及更好的抗炎和免疫调节活性，而源于该类MSC的EV则保留了亲代细胞的某些优势[26]。Wang等的研究同样在动物模型中证明ESC-MSC外泌体可以通过平衡细胞外基质中II型胶原蛋白的合成与基质降解酶的表达阻止OA病变进展[27]。并且有研究观察到由ESC-MSC-EV治疗的软骨缺损表现出形态良好的透明软骨生成，与周围原有的软骨组织可以完全结合[28]。但是，伦理学上的争议限制了该类型MSC的广泛研究。

诱导型多能干细胞（iPSC）则可以由成人或患者自身的各种体细胞经iPS技术诱导形成，避开了胚胎干细胞的伦理限制，这使得iMSC可以更微创的方式获取，不受来源数量的限制[29]。并且iMSC在细胞增殖，免疫调节，细胞因子谱，调节外泌体的产生以及旁分泌因子的分泌方面更具优势[30]。Greca等的研究表明和iPSC衍生的EV相比，iMSC分泌的EV富含细胞外基质、细胞基质粘附、运动和细胞运动蛋白，表明其具有更强的组织修复能力[31]。Zhu等比较了来自iMSCs和SMMSCs的外泌体对OA的治疗作用，在小鼠膠原酶诱导的OA模型中，iMSC或SMMSC外泌体的关节内注射均可减轻OA，刺激软骨细胞迁移和增殖，但相比之下iMSC-Exos表现出更显著的治疗效果[32]。

6小結

目前为止，对相关文献的系统回顾已经证明MSC-EVs在促进OA软骨细胞迁移和增殖，促进ECM合成，抗分解代谢以及抗炎和免疫调节方面的积极作用。从目前的研究进程来看，EV作为一种细胞间通讯媒介，其中的miRNA和丰富的旁分泌因子起主要作用，但是尚没有一个相对完整的作用谱系被表征出来。不同来源的EV缺乏在生物学特性及治疗效果等方面的系统对比，因此尚无法基于综合优势选择出最佳的EV来源。对EV以某些方式进行预处理确实可以不同程度地增强EV的治疗作用，但是目前这方面的研究只是提供了一些方向，由于各种研究在试验方法及疗效标准方面多有不同，因此较难形成统一的证据。总之，目前的研究初步明确了EV在用于治疗骨关节炎的前景，但是我们还缺乏对其内容物的详尽了解，尚无法建立起完整的作用机制网络来阐明其临床疗效与安全性，这需要我们更多进一步的的研究。

参考文献：

[1]王琪，姜大朋.间充质干细胞来源的细胞外囊泡与肾损伤修复[J].临床泌尿外科杂志，2020，35（03）：233-236.

[2]Garg M， Potter JA， Abrahams VM. Identification of microRNAs that regulate TLR2-mediated trophoblast apoptosis and inhibition of IL-6 mRNA. PLoS One. 2013;8（10）e77249

[3]高沿航，王春光，高普均，胡振华，张松灵，李玉林.核因子κB在HGF介导的人胎儿肝干细胞增殖分化作用中的变化及意义[J].临床肝胆病杂志，2009，25（04）：243-246.

[4] Thielen NGM， van der Kraan PM， van Caam APM. TGFβ/BMP Signaling Pathway in Cartilage Homeostasis.Cells. 2019;8（9）：969. Published 2019 Aug 24. doi：10.3390/cells8090969

[5] Ruiz M， Toupet K， Maumus M， et al. TGFBI secreted by mesenchymal stromal cells ameliorates osteoarthritis and is detected in extracellular vesicles. Biomaterials. 2020;226：119544. doi：10.1016/j.biomaterials.2019.119544

[6] 刘毅毅，李林，李小薇，尤晓苗，袁旭，王馨.MicroRNAs在TLR/NF-кB信号通路中的研究进展[J].世界最新医学信息文摘，2018，18（A5）：115-116+119.

[7]谭震，厉小梅.骨关节炎与免疫[J].中国实用内科杂志，2019，39（08）：674-676+680.

[8]Gomzikova M O， James V， Rizvanov A A. Therapeutic Application of Mesenchymal Stem Cells Derived Extracellular Vesicles for Immunomodulation[J]. Frontiers in immunology， 2019， 10： 2663-2663.

[9]Harrell C.R.， Fellabaum C.， Jovicic N.， Djonov V.， Arsenijevic N.， Volarevic V. Molecular Mechanisms Responsible for Therapeutic Potential of Mesenchymal Stem Cell-Derived Secretome. Cells. 2019;8：467. doi： 10.3390/cells8050467.

[10] 何萌，陈娟，伍金林.间充质干细胞通过调控巨噬细胞极化实现免疫应答的研究现状[J].中华妇幼临床医学杂志（电子版），2019，15（05）：492-496.

[11] Wang J， Xia J， Huang R， et al. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles alter disease outcomes via endorsement of macrophage polarization[J]. Stem Cell Research & Therapy， 2020， 11（1）.

[12]Choi M C， Jo J， Park J， et al. NF-κB Signaling Pathways in Osteoarthritic Cartilage Destruction[J]. Cells， 2019， 8（7）.

[13] 孟庆良，周子朋，郑福增，谷慧敏，左瑞庭，王慧莲，苗喜云，刘晓玉，王莉莎，孟婉婷.骨关节病患者关节软骨组织中MMP-1及MMP-3与TIMP3的临床表达意义[J].中国地方病防治杂志，2016，31（09）：988-989+1022.

[14] Ghosh AK， Vaughan DE. PAI-1 in tissue fibrosis. J Cell Physiol. 2012;227（2）：493-507. doi：10.1002/jcp.22783

[15] Thielen NGM， van der Kraan PM， van Caam APM. TGFβ/BMP Signaling Pathway in Cartilage Homeostasis. Cells. 2019;8（9）：969. Published 2019 Aug 24. doi：10.3390/cells8090969

[16] Montaseri A， Busch F， Mobasheri A， et al. IGF-1 and PDGF-bb suppress IL-1β-induced cartilage degradation through down-regulation of NF-κB signaling： involvementof Src/PI-3K/AKTpathway.PLoS One. 2011;6（12）：e28663. doi：10.1371/journal.pone.0028663

[17] 邓桢翰，黄勇，肖璐璐，陈昱霖，朱伟民，陆伟，王大平.骨形态发生蛋白在关节软骨再生过程中的作用与应用[J].中国组织工程研究，2021，25（05）：798-806.

[18] Domenis R， Cifù A， Quaglia S， et al. Pro inflammatory stimuli enhance the immunosuppressive functions of adipose mesenchymal stem cells-derived exosomes[J]. Scientific reports， 2018， 8（1）： 1-11.

[19]邊素艳，刘姗姗，刘宏斌，等. 缺氧预处理人骨髓间充质干细胞衍生细胞外囊泡的 microRNAs 表达谱分析[J].解放军医学院学报，2020，41（11）.

[20] 彭侃，鲁超，胡守业，井文森，王波.过表达miR-140-5p的人脐带间充质干细胞对骨关节炎的治疗作用[J].山西医科大学学报，2020，51（08）：825-833.

[21] Mao G， Zhang Z， Hu S， et al. Exosomes derived from miR-92a-3p-overexpressing human mesenchymal stem cells enhance chondrogenesis and suppress cartilage degradation via targeting WNT5A. Stem Cell Res Ther. 2018;9（1）：247. Published 2018 Sep 26. doi：10.1186/s13287-018-1004-0

[22] 张季永，崔维顶.不同间充质干细胞来源的外泌体治疗骨关节炎的研究进展[J].南京医科大学学报（自然科学版），2020，40（05）：768-772.

[23]柯旖旎，林进.间充质干细胞治疗骨关节炎应用进展[J].中国实用内科杂志，2019，39（08）：677-680.

[24]Sabol RA， Bowles AC， Côté A， et al. Therapeutic Potential of Adipose Stem Cells [published online ahead of print， 2018 Jul 27]. Adv Exp Med Biol. 2018;10.1007/5584_2018_248. doi：10.1007/5584_2018_248

[25] Gimble JM， Katz AJ， Bunnell BA. Adipose-derived stem cells for regenerative medicine. Circ Res. 2007;100（9）：1249-1260. doi：10.1161/01.RES.0000265074.83288.09

[26] Hawkins KE， Corcelli M， Dowding K， et al. Embryonic Stem Cell-Derived Mesenchymal Stem Cells （MSCs） Have a Superior Neuroprotective Capacity Over Fetal MSCs in the Hypoxic-Ischemic Mouse Brain. Stem Cells Transl Med. 2018;7（5）：439-449. doi：10.1002/sctm.17-0260

[27] Wang Y， Yu D， Liu Z， et al. Exosomes from embryonic mesenchymal stem cells alleviate osteoarthritis through balancing synthesis and degradation of cartilage extracellular matrix. Stem Cell Res Ther. 2017;8（1）：189. Published 2017 Aug 14. doi：10.1186/s13287-017-0632-0

[28] Zhang S， Chu WC， Lai RC， et al. Exosomes derived from human embryonic mesenchymal stem cells promote osteochondral regeneration. Osteoarthritis Cartilage. 2016;24（12）：2135-2140. doi：10.1016/j.joca.2016.06.022

[29]夏国明，许强，刘序强，于小龙，戴闽.诱导多能干细胞在骨外科组织工程中的应用与作用[J].中国组织工程研究，2021，25（19）：3077-3082.

[30] Sabapathy V， Kumar S. hiPSC-derived iMSCs： NextGen MSCs as an advanced therapeutically active cell resource for regenerative medicine. J Cell Mol Med. 2016;20（8）：1571-1588. doi：10.1111/jcmm.12839

[31]La Greca A， Solari C， Furmento V，et al. Extracellular vesicles from pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells acquire a stromal modulatory proteomic pattern during differentiation. Exp Mol Med. 2018 Sep 10;50（9）：119. doi： 10.1038/s12276-018-0142-x. PMID： 30201949; PMCID： PMC6131549.

[32] Zhu Y， Wang Y， Zhao B， et al. Comparison of exosomes secreted by induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells and synovial membrane-derived mesenchymal stem cells for the treatment of osteoarthritis. Stem Cell Res Ther. 2017;8（1）：64. Published 2017 Mar 9. doi：10.1186/s13287-017-0510-9

作者简介：蔡龙云，1993.12，男，汉族，江西会昌人，硕士研究生，研究方向：骨与关节损伤与骨病研究。

通信作者：林宗汉 Email：LZH1965555@163.com